Trans-indre celle masse injektion af stamceller fra embryoner fører til højere kimærisme
Summary
Her præsenterer vi en protokol for at øge chimera produktion uden brug af nyt udstyr. En simpel orientering ændring af embryo til injektion kan øge antallet af embryoner produceret og potentielt reducere tidslinjen til kønscelleoverførsel transmission.
Abstract
I et forsøg på at øge effektiviteten i skabelsen af genmodificerede mus via ES celle metoder, præsenterer vi en tilpasning til de nuværende blastocyst injektion protokol. Vi rapporterer her, en enkel rotation af embryo og injektion gennem Trans-indre cellemasse (TICM) steg andelen af kimære Mus fra 31% til 50%, uden ekstra udstyr eller yderligere specialuddannelse. 26 forskellige indavlede kloner, og 35 samlede kloner blev injiceret over en periode på 9 måneder. Der var ingen signifikant forskel i enten graviditetsrate eller genfindingsprocenten for embryoner mellem traditionelle injektionsteknik og TICM. Derfor uden større ændring i indsprøjtningssystem processen og en simpel positionering af blastocyst og indsprøjte gennem ICM, kan frigive ES-celler i blastocoel hulrum potentielt forbedre mængden kimære produktion og efterfølgende kønscelleoverførsel transmission.
Introduction
I næsten 25 år, har oprettelsen af genetisk målrettede mus været en langsommelig proces, ofte hæmmet af en flaskehals på stadiet blastocyster ES celle mikroinjektion for generation af kønscelleoverførsel sender kimærer. De seneste fremskridt, herunder CRISPR/Cas91,2 målretning i ES-celler og høj overførselshastighed ES celle generation konsortier som KOMP, har forbedret generation/tilgængelighed af genetisk modificerede celler, ES. Generation af kønscelleoverførsel kimærer er imidlertid fortsat en flaskehals i at skabe genetisk modificerede mus fra disse ES celler3,4. Høj overførselshastighed ES celle generation projekter har været plaget af høj variabilitet i ES celle kvalitet, som er afgørende for vellykket skabelse af kønscelleoverførsel kimærer. Derudover er nogle af de almindeligt udnyttede ES cellelinjer kendt for høj aneuploidi og vanskelig produktion af kønscelleoverførsel kompetente kimærer5.
Mange metoder er blevet udviklet for at skabe mus med enten en højere chimera, eller helt ES celle afledte mus6,7,8,9,10. Mens hver af disse systemer har sine egne meritter, har de også deres svagheder. Generation af tetraploide kimærer, mens generere 100% ES celle afledte mus, er ineffektive, og er generelt begrænset til outbred linjerne 5,6. Nyere metoder til indsprøjtning morula kan give høj procentdel kimærer, nærmer sig 100%, men generelt kræver betydelige yderligere udstyr (lasere eller piezos) og uddannelse10,11. I laboratorier, hvor disse teknikker er allerede på plads, kan denne nye metode ikke være nødvendigt.
Denne undersøgelse mål var at finde en metode, der bruger almindelige teknikker og let tilgængelige udstyr til at øge hastigheden af chimera generation, øge chancen for kønscelleoverførsel transmission af den mutante allel at etablere efterfølgende mus koloni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har længe været tænkt, at enhver forstyrrelse af ICM kunne føre til dødelighed, faktisk nuværende blastocyst mikroinjektion protokoller stadig advare denne12,13. Her har vi vist er der mikroinjektion gennem ICM er ikke skadeligt for fosteret, og øger udbyttet af kimærer.
Den nøjagtige mekanisme for denne effekt er ikke blevet identificeret. Den mekanisk afbrydelse af ICM, og den ledsagende hypoblast, bør imidlertid øge f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet [del] af murene forskningsprogrammet af NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Særlig tak til Shyamal Peddada for statistisk analyse. Vi vil også gerne takke Humphrey Yao, Gary fugl og Yuki Arao for gennemgang af dette manuskript og Franco DeMayo for hans fortsatte støtte og rådgivning.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse embryo. , (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. . Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
