Транс внутренняя ячейка массы впрыска эмбриональных стволовых клеток приводит к более высоким ставкам химеризма
Summary
Здесь мы представляем протокол для увеличения производства Химера без использования нового оборудования. Изменение простой ориентации эмбриона для инъекций может увеличить количество зародышей и потенциально сократить сроки передачи микрофлорой.
Abstract
В целях повышения эффективности в деле создания генетически измененных мышей через клетки ES методологии мы представляем адаптация к нынешнему Протоколу инъекции бластоциста. Здесь мы приводим простой поворот эмбрион, и инъекции через транс-внутренней клеточной массы (TICM) увеличение доли химерных мышей от 31% до 50%, без дополнительного оборудования или дальнейшей специализированной подготовки. 26 различных инбредных клонов, и 35 всего клоны были введены в течение 9 месяцев. Существует никакого существенного различия в беременности или скорость восстановления эмбрионов между традиционными инъекций методы и TICM. Таким образом без каких-либо крупных изменений в процессе впрыска и простого позиционирования бластоцисты и инъекций через ICM, выпустив ES клеток в полость blastocoel потенциально может улучшить количество химерных производства и последующего микрофлорой передачи.
Introduction
Почти 25 лет создание генетически целенаправленные мышей был медленный процесс, часто препятствует узкое место на этапе микроинъекции клеток бластоцисты ES для поколения микрофлорой, препровождающее химер. Последние достижения, включая ТРИФОСФАТЫ/Cas91,2 ориентации в клетки ES и высок объём ES клеток поколения консорциумов как комп, улучшили поколения/наличие генетически модифицированных ES клеток. Однако поколение микрофлорой химер остается узким местом в создании генетически измененных мышей от этих клеток ES3,4. Высок объём ES клеток поколения проектов были страдает от высокой изменчивости качества клеток ES, который имеет решающее значение для успешного создания химер микрофлорой. Кроме того некоторые из часто используемых линий клетки ES известны высокой анеуплоидии и сложные производства микрофлорой компетентным химер5.
Многие методы были разработаны для создания мышей с либо выше химера, или полностью клеток ES производных мышей6,,78,9,10. Хотя каждая из этих систем имеет свои достоинства, они также имеют свои недостатки. Поколение тетраплоидные химер, в то время как генерации клеток ES 100% полученных мышей, является неэффективным и обычно ограничивается беспородных линии 5,6. Новые методы инъекций морулы может принести высокий процент химер, приближается к 100%, но как правило, требуют значительного дополнительного оборудования (лазеры или piezos) и подготовки10,11. В лабораториях, где эти методы уже на месте эта новая методология не может быть необходимым.
Это исследование цель заключалась в том, чтобы найти метод, который использует общие методы и оборудование легко доступны для увеличения скорости поколения химера, увеличивая микрофлорой передачи аллеля мутанта шанс создать последующие мыши колонии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Долго думал, что любое нарушение ICM может привести к смертности, в самом деле, текущий бластоциста микроинъекции протоколы еще предупредить этот12,13. То, что мы показали здесь, что микроинъекции через ICM не наносит ущерба эмбриона и увеличивает доходность х…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано [в частности] интрамуральных исследовательской программы NIH, Национальный институт экологических наук о здоровье. Особая благодарность Shyamal Peddada для статистического анализа. Мы также хотим поблагодарить Хамфри Яо, Гэри птица и Yuki Arao для обзора этой рукописи и Франко мая за его неизменную поддержку и консультации.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse embryo. , (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. . Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
