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Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

Published: December 22, 2017
doi:
10.3791/56956
, , ,
1Department of Chemistry,George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology,George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry,University of Maryland, College Park

Summary

Descrevemos as etapas que permitem rápida situ em amostragem de uma pequena porção de uma célula individual com alta precisão e mínima invasão usando microamostragem baseada em capilar, para facilitar a caracterização química de um instantâneo da atividade metabólica em viver de embriões utilizando uma plataforma de espectrometria de massa e eletroforese capilar Custom-Built única célula.

Abstract

A quantificação de pequenas moléculas em células únicas gera novos potenciais para melhor compreender os processos básicos que fundamentam o desenvolvimento embrionário. Para habilitar monocelulares investigações diretamente em embriões vivos, novas abordagens analíticas são necessários, especialmente aqueles que são sensíveis, seletiva, quantitativos, robusta e escalável para tamanhos diferentes da célula. Aqui, apresentamos um protocolo que permite a análise em situ do metabolismo nas células únicas no livremente desenvolvimento de embriões do Sul Africana Xenopus (Xenopus laevis), um poderoso modelo em biologia celular e do desenvolvimento. Esta abordagem usa uma microsonda capilar para aspirar uma porção definida de simples células identificadas no embrião, deixando as células vizinhas intactas para análise posterior. O conteúdo da célula coletado é analisado por uma interface de microescala eletroforese capilar electrospray ionização (CE-ESI) acoplada a um espectrômetro de massa em tandem de alta resolução. Esta abordagem é escalável para vários tamanhos de célula e compatível com a complexa estrutura tridimensional do embrião em desenvolvimento. Como exemplo, demonstramos que microsonda que monocelulares CE-ESI-MS permite a elucidação de heterogeneidade celular metabólica que se desdobra como uma célula progenitora dá origem a descendentes durante o desenvolvimento do embrião. Além de célula e biologia do desenvolvimento, os protocolos de célula única análise descritos aqui são aptos para outros tamanhos de células, tipos de células ou modelos animais.

Introduction

Uma compreensão abrangente do desenvolvimento embrionário exige caracterização de todas as alterações moleculares que se desenrolam em cada célula do organismo em desenvolvimento. Enquanto a próxima geração de sequenciamento com amplificação molecular permite medição profunda de célula única transcriptomes1 em desenvolvimento sistemas2,3, consideravelmente menos é conhecida sobre o conjunto de moléculas menores produzido em células embrionárias única, incluindo proteínas e, especialmente, metabólitos (massa molecular < Da ~ 1.500). Com uma resposta rápida e dinâmica de eventos intrínsecos e extrínsecos, o metabolome serve como um poderoso descritor de estado molecular da célula. O metabolome de célula única, portanto, aumenta o potencial para acompanhar o desenvolvimento espacial e temporal da heterogeneidade celular no embrião precoce e identificar novas moléculas para estudos funcionais. No entanto, sem amplificação molecular disponível para estas moléculas, deteção da metabolome exige sensibilidade excepcional utilizando espectrometria de massa (MS), que é a tecnologia de escolha para a análise do metabólito.

MS de célula única é uma coleção de tecnologias com sensibilidade suficiente para medir metabólitos em células individuais (ver comentários 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Reprodutível amostragem de células e extração eficiente de metabólitos são essenciais para a detecção bem sucedida de metabólitos em células únicas. Dissecação de células inteiras de identificadas células de embriões de Xenopus permitiu a caracterização de moléculas pequenas e peptídeos16. Outras abordagens empregam micropipetas para células individuais ao vivo, seguidas de deteção usando ionização electrospray (ESI) MS da amostra. Por exemplo, metabólitos foram medidos na planta ou células de mamíferos por célula única vídeo MS17, sonda de pressão18, única sonda19e microscopia fluídico força20, entre outras técnicas21, 22,23,24. Além disso, a incorporação de separação química antes de ionização para o fluxo de trabalho MS monocelulares eficientemente simplifica a metabolome, aliviando assim, a potenciais interferências durante a geração de íon antes da detecção. Importante, a separação também fornece informações específicas do composto para auxiliar na identificação molecular. Eletroforese capilar (CE) tem sido usado para detectar metabolitos nos neurônios de2726 ou microsampled único dissecado25,, capturando pequeno-molécula diferenças entre fenótipos de neurônio. Nós recentemente adaptado CE para ESI em tandem MS para habilitar a detecção de nível de rastreamento de centenas de metabólitos em células individuais que foram dissecados de embriões adiantados do Xenopus laevis16,28. Estes estudos revelaram diferenças metabólicas surpreendentes entre células embrionárias na fase inicial de desenvolvimento e levaram à descoberta de metabólitos com anteriormente desconhecidos impactos no desenvolvimento16.

Aqui nós fornecemos um protocolo que permitiu a detecção de metabólitos em únicas pilhas diretamente em um embrião de vertebrados ao vivo usando microsonda monocelulares CE-ESI-MS29,30. O organismo modelo escolhido é a 8-a-32-célula X. laevis embrião, embora a abordagem também é aplicável aos últimos estágios de desenvolvimento e outros tipos de organismos modelo. Este protocolo usa capilares afiados com multi-eixo controle translacional sob orientação por um sistema de imagens de alta resolução para aspirar uma porção de nL ~ 10 de células identificadas em situ no desenvolvimento do embrião morfologicamente complexo. Este microsonda é escalável para células menores e opera dentro de segundos, que é suficientemente rápido para acompanhar as linhagens de células no embrião. Depois de extrair polar ou apolar pequenas moléculas, tais como metabólitos e peptides, da amostra coletada em ~ 4-5 solução de extração µ l, uma ~ 10 nL do extrato resultante é analisada em uma plataforma de CE Custom-Built hifenizada de um espectrômetro de massa ESI. Construção e operação da plataforma CE-ESI-MS baseia-se em protocolos descritos em outro lugar. 31 , 32 a interface CE-ESI co-axial é construída conforme descrito em outro lugar. 31 esta plataforma é mantida no regime de pulverização de cone-jato para atingir o nível de rastreamento sensibilidade, com uma capacidade para quantificação sobre uma gama dinâmica de log-ordem de 4-5 (relativo28,29,30 ou absoluto16). A plataforma de CE-ESI-MS oferece um limite de detecção com 8% desvio-padrão relativo (RSD) 60-amol na quantificação sobre um intervalo testado de 10 nM a 1 µM para pequenas moléculas,16, que são suficientes para caracterizar metabólitos endógenos, em X. laevis células. Microprobed células continuam a dividir-se no decorrer do embrião, através de desenvolvimento30, permitindo a análise temporal e espacialmente resolvido de metabolismo celular. De facto, única célula CE-ESI-MS pode ser usado para encontrar diferenças metabólicas entre as células que ocupam o dorso-ventral16,29, animal-vegetal,16e esquerda-direita28 eixos do desenvolvimento bem como células que formam a tecido neural predestinada linhagem dorsal de uma célula progenitora comum em X. laevis30. Além de consultar as diferenças metabólicas entre células embrionárias individuais em diferentes fases do desenvolvimento do embrião X. laevis 30, prevemos que os protocolos aqui descritos são aplicáveis a uma ampla gama de biomoléculas e microsampled de células individuais de diferentes fases do desenvolvimento embrionário, bem como outros tipos de células e organismos-modelo. Além disso, a microsonda poderia ser usada para microsampling enquanto uma plataforma diferente compatível com amostras minúsculas pode ser usada para a separação e/ou caracterização de biomoléculas.

Protocol

Todos os protocolos relacionados à manutenção e manipulação de Xenopus laevis foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade George Washington e institucional Cuidado Animal (IACUC nenhum. A311). 1. preparação dos instrumentos, meios de comunicação, solventes de amostragem e pratos de amostragem Preparar 1 x solução de Steinberg (SS), dissolvendo os seguintes sais em água ultrapura (~18.2 MΩ.cm a 25 ° C), na seguinte ordem e nas concentrações indicadas…

Representative Results

Nós recentemente empregados microsonda monocelulares CE-ESI-MS para caracterizar metabólitos em células individuais identificados livremente desenvolver embriões de Xenopus laevis 29,30. A microsonda permite rápido (~ 5 seg/cell), em situ aspiração de ~ 10 nL de uma célula individual, múltiplas aspirações da mesma célula, ou várias células diferentes dentro da mesmas ou posteriores estágios de dese…

Discussion

Microprobe CE-ESI-MS permite a caracterização directa dos metabolitos em células únicas em viver, livremente desenvolver embriões. O cerne da abordagem são dois subcomponentes técnicas, nomeadamente em situ microsampling capilar e alta sensibilidade CE-ESI-MS. em comparação à dissecação de células inteiras, microsampling capilar tem a vantagem de operação rápida (alguns segundos vs 5 min pilha / por dissecação), compatibilidade com a morfologia tridimensional complexa de embriões e escalabilid…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela National institutos de saúde subsídios GM114854 (de Parque Nacional) e CA211635 (de Parque Nacional), o Arnold e Mabel Beckman Fundação Beckman Young Investigator concedem (Parque Nacional), o prêmio DuPont jovem Professor (de Parque Nacional), a sociedade americana para a missa Prêmio de pesquisa espectrometria (de Parque Nacional) e bolsas COSMOS Club Foundation (para R.M.O e E.P.P.). As opiniões e conclusões expressadas nesta publicação são exclusivamente dos autores e não necessariamente representam a opinião oficial das fontes de financiamento.

Materials

Reagents for Embryo Culture Media
Potasium chloride Fisher Scientific BP 366-1
Magnesium sulfate Fisher Scientific M 65-3
Calcium nitrate Sigma Aldrich C1396
Cysteine MP Biomedicals 101444
Trizma hydrochloride Sigma Aldrich T3253
Trizma base Sigma Aldrich T1503
Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
Name Company Catalog Number Comments
Metabolite Extraction Solvents
Acetonitrile (LC-MS-grade) Fisher Scientific A955
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Name Company Catalog Number Comments
Solvents and Standards for CE-ESI-MS
Formic acid (LC-MS-grade) Fisher Scientific A11710X1-AMP
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456-4
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
Acetylcholine chloride Acros Organics 159170050
Name Company Catalog Number Comments
Microprobe Fabrication Setup
Micropippette puller Sutter Instrument Co. P-1000
Borosilicate capillaries Sutter Instrument Co. B100-50-10
Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel Fine Science Tools (USA) Inc 11252-30 Corrosion resitant and autoclavable.
Name Company Catalog Number Comments
Microprobe Sampling Setup
Micromanipulator Eppendorf, Hauppauge, NY TransferMan 4r
Stereomicroscope Nikon SMZ18 Should be vibrationally isolated.
Illuminator e.g. Goosenecks Nikon C-FLED2
Microinjector Warner Instrument, Handem, CT PLI-100A
Transfer pipettes (Plastic, disposable) Fisher Scientific 13-711-7M
Petri dish 60 mm and 80 mm Fisher Scientific S08184
Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) Fisher Scientific 13-678-20A
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend X1R
Name Company Catalog Number Comments
CE-ESI-MS Setup
High voltage power supply Spellman CZE1000R The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.
Syringe pumps (2) Harvard Apparatus 704506
Stereomicroscope Amscope SM-3BZZ Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.
XYZ translation stage Thorlabs PT3
XYZ translation stage Custom-built This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary
Stainless steel sample vials Custom-built
Stainless steel BGE vial Custom-built
Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP040105
Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP075375
Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) Hamilton Co. 21031A For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.
Syringes (gas-tight): 500 – 1000 µL Hamilton Co. 1750TTL
Digital multimeter Fluke Fluke 117
High-resolution Mass Spectrometer Bruker Daltonics Maxis Impact HD High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI
Tunning mixture for mass spectrometer calibration Agilent technologies ESI-L G1969-85000
Data Analysis ver. 4.3 software Bruker Daltonics
Name Company Catalog Number Comments
Ancillary Equipment
Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C Labconco 7310022
Analytical microbalance (XSE105DU) Fisher Scientific 01911005
Freezer (-20 °C) Fisher Scientific 97-926-1
Freezer (-80 °C) Fisher Scientific 88300ASP
Refrigerated Incubator Fisher Scientific 11475126
Vortex-mixer Benchmark BS-VM-1000
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References

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Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos. J. Vis. Exp. (130), e56956, doi:10.3791/56956 (2017).
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