Geautomatiseerde meting van Cryptococcal soorten Polysaccharide Capsule en cel lichaam
Summary
Deze techniek wordt beschreven van een geautomatiseerde batch-beeldprocessor, bedoeld voor het meten van de polysacharide capsule en lichaam stralen. Hoewel oorspronkelijk ontworpen voor Cryptococcus neoformans capsule metingen die de geautomatiseerde image processor kan ook worden toegepast op andere gebaseerd contrastdetectie van cirkelvormige objecten.
Abstract
Het doel van deze techniek is om te zorgen voor een consistente, nauwkeurige en beheersbaar proces voor grote aantallen polysaccharide capsule metingen.
Ten eerste, een drempel afbeelding is gegenereerd op basis van intensiteitswaarden uniek berekend voor elke afbeelding. Vervolgens worden cirkels gedetecteerd op basis van contrast tussen het object en de achtergrond met behulp van de gevestigde cirkel Hough transformatie (CHT) algoritme. Tot slot de gedetecteerde cel capsules en organen worden vergeleken volgens center coördinaten en RADIUS-grootte en gegevens worden geëxporteerd naar de gebruiker in een beheersbare werkblad.
De voordelen van deze techniek zijn eenvoudige maar belangrijke. Eerste, omdat deze berekeningen worden uitgevoerd door een algoritme in plaats van een mens zowel de nauwkeurigheid en de betrouwbaarheid zijn verhoogd. Er is geen achteruitgang in de nauwkeurigheid of betrouwbaarheid ongeacht hoeveel monsters worden geanalyseerd. Ten tweede, deze aanpak stelt een potentiële standaard gebruiksprocedure voor het Cryptococcus veld in plaats van de huidige situatie waar capsule meting per lab verschilt. Ten derde, gezien het feit dat handmatige metingen van de capsule zacht en monotoon, automatisering kunt snelle metingen op grote aantallen van gistcellen die op zijn beurt vergemakkelijkt hoge doorvoer data-analyse en steeds krachtiger statistieken.
De belangrijkste beperkingen van deze techniek vandaan hoe het algoritme-functies. Ten eerste zal het algoritme alleen genereren cirkels. Hoewel Cryptococcus cellen en hun capsules over een circulaire morfologie nemen, zou het moeilijk om deze techniek van toepassing op niet-cirkelvormige object detectie. Ten tweede, als gevolg van hoe cirkels worden gedetecteerd de CHT-algoritme kan detecteren enorme pseudo-cirkels op basis van de buitenste randen van verschillende geclusterde cirkels. Echter kan een verdraaid cel organen gevangen binnen de pseudo-cirkel gemakkelijk worden gedetecteerd en verwijderd uit het resulterende gegevenssets.
Deze techniek is bedoeld voor het meten van de circulaire polysaccharide capsules van Cryptococcus soorten op basis van de Oost-Indische inkt helder veld microscopie; Hoewel het kan worden toegepast op andere contrast gebaseerd circulaire object metingen.
Introduction
Cryptococcus neoformans is een pathogene gist overal gevonden over de hele wereld dat is gekoppeld aan ziekten bij de mens vooral in immunosuppressie populaties. C. neoformans is vooral goed voor een beduidende oorzaak is van de totale jaarlijkse sterfgevallen in sub-Saharisch Afrika als gevolg van besmettelijke ziekte1. De belangrijke klinische manifestatie van cryptococcal infectie is meningo, die invasie van het centrale zenuwstelsel door vervoer in besmette macrophages (Trojaans paard wijze volgt) of directe overschrijding van de bloed – hersenbarrière. C. neoformans spreekt verschillende virulentiefactoren waaronder de mogelijkheid om te repliceren op menselijke lichaamstemperatuur, ureaseactiviteit, melanization en vorming van een polysaccharide capsule2. De polysaccharide capsule bestaat uit herhalende glucuronoxylomannan en glucoronoxylomannangalactan polymeren en functies als een beschermende barrière tegen factoren, zoals milieudruk en host immuunrespons op2.
Hoewel de grootte van de cryptococcal polysaccharide capsule grootte niet consequent gekoppeld aan de virulentie heeft, is er bewijs dat er een factor in de pathogenese2,3,4,5, 6,7. Capsule grootte is gekoppeld aan meningitis pathologie6, kan invloed uitoefenen op macrophage Cryptococcus infectie5controle, en kan resulteren in verlies van virulentie als afwezig8. Vandaar, capsule grootte metingen zijn gebruikelijk in cryptococcal onderzoek, maar er bestaat geen fieldwide standaard voor een methode voor de meting van de capsule.
Momenteel, C. neoformans polysaccharide capsule waardering is gebaseerd op handmatige metingen van microscopie beelden, en de exacte methoden van zowel de afbeelding als de meting acquisities variëren tussen laboratoria9,10, 11. Een directe zorg aan deze methode is dat sommige studies vereisen de verwerving van duizenden afzonderlijke metingen, waardoor handhaving nauwkeurigheid en betrouwbaarheid moeilijk. Bovendien, zelfs wanneer de resultaten worden gepubliceerd, er is vaak onvoldoende beschrijving van de meetmethode. Vele publicaties niet uitleggen hoe hun metingen werden verkregen, wat brandvlak werd gebruikt, hoe zij vastbesloten de drempel voor de identificatie van de capsule, of ze gebruikt RADIUS- of diameter, of ze een meting gebruikt of gemiddeld aantal, of andere Details. Sommige publicaties alleen staat hun methode als welk programma is gebruikt, bijvoorbeeld “Adobe Photoshop CS3 werd gebruikt voor het meten van de cellen”11. Dit gebrek aan standaardisatie en rapportage van detail kan maken reproduceerbaarheid moeilijk zo niet onmogelijk. Verschillen in menselijk gezichtsvermogen, computer helderheid, Microscoop instellingen, schuif de verlichting, en andere factoren kunnen variëren niet alleen tussen individuen, maar ook tussen de monsters, overwegende dat de berekeningen op basis van ratio’s van pixelwaarden intensiteit constant zal blijven en toepassing tussen de monsters. Deze techniek werd gemaakt in het kader van het verstrekken van een gestandaardiseerde, nauwkeurige, snelle en eenvoudige techniek voor het meten van capsules maten voor een veld waarin er geen vóór was.
Zoals eerder vermeld, de CHT-algoritme is reeds lang gevestigde, en scripts automatisch detecteert cirkels zijn geschreven vóór. Deze methode verbetert in twee gebieden waar andere scripts zou tekortkomen. Eerst, simpelweg het opsporen van cirkels is niet genoeg, omdat met cryptococcal cellen twee verschillende cirkels ten opzichte van elkaar moeten worden gedetecteerd. Deze methode specifiek detecteert cel organen binnen capsules, discrimineert tussen de twee, en berekeningen alleen op de relevante instantie-capsule paren. Ten tweede, zelfs wanneer na de hetzelfde protocol, de verschillende onderzoekers zullen eindigen met verschillende verworven beelden. Doordat de onderzoeker controle over elk algoritme-parameter, kan deze tool worden aangepast aan een breed scala van overname methoden. Er is geen behoefte aan een gestandaardiseerde toepassingsgebied, doelstelling, filter, enzovoort.
Deze techniek kan gemakkelijk worden toegepast op elke situatie waarin de onderzoeker moet detecteren cirkels binnen een afbeelding die contrast met hun achtergrond. Beide cirkels lichter en donkerder dan hun achtergrond kan worden opgespoord, geteld en gemeten met behulp van deze techniek.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritische fasen van deze techniek zijn voorbereiding van de Oost-Indische inkt dia en de Microscoop afbeeldingen ophalen. Terwijl het algoritme met succes met een verscheidenheid van dia en beeld technieken getest is wordt het aanbevolen protocol beschreven in dit manuscript. De polysaccharide capsule wordt gedetecteerd op basis van de uitsluiting van de Oost-Indische inkt deeltjes uit het domein van de capsule zoals deze deeltjes zijn te groot om door te dringen de polysacharide fibril netwerk. Oost-Indische inkt uit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen erkennen Anthony Bowen waarvan dia’s werden gebruikt als een tweede menselijke side-by-side vergelijking evenals Sabrina Nolan waarvan dia’s werden gebruikt als een derde menselijke side-by-side en de tweede vergelijking van de Microscoop.
Materials
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22×22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).
- Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), 007 (2013).
- Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Araujo, G. d. e. S., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).
- García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
- Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
- Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
