Mesure automatique de Capsule de Polysaccharide cryptococcique espèces et corps cellulaire
Summary
Cette technique décrit un processeur d’image batch automatisé conçu pour mesurer les rayons de corps et de la capsule polysaccharidique. Initialement conçu pour les mesures capsules Cryptococcus neoformans , que le processeur d’image automatisé peut également s’appliquer aux autre détection de contraste basé des objets circulaires.
Abstract
Le but de cette technique est de fournir un processus cohérent, précis et facile à gérer pour un grand nombre de mesures capsule polysaccharidique.
Tout d’abord, une image de seuil est générée en fonction sur les valeurs d’intensité unique calculés pour chaque image. Puis, cercles sont détectés basée sur le contraste entre l’objet et l’arrière-plan à l’aide de l’algorithme de Transformation de Hough de cercle (CHT) bien établi. Enfin, les capsules de cellules détectées et les organes sont adaptées selon les coordonnées du centre et de la taille du rayon, et données sont exportées vers l’utilisateur dans un tableur facile à gérer.
Les avantages de cette technique sont simples mais importantes. Tout d’abord, parce que ces calculs sont effectués par un algorithme plutôt qu’un être humain l’exactitude et la fiabilité sont augmentés. Il n’y a pas de déclin dans l’exactitude ou la fiabilité peu importe combien d’échantillons est analysés. Deuxièmement, cette approche établit un mode opératoire normalisé potentiel pour le champ de Cryptococcus plutôt que de la situation actuelle où les capsule mesure varie selon le laboratoire. Troisièmement, étant donné que les mesures capsules manuelles sont lent et monotone, automation permet des mesures rapides sur un grand nombre de cellules de levure qui à son tour facilite l’analyse de données à haut débit et des statistiques de plus en plus puissants.
Les principales limites de cette technique viennent de comment les fonctions de l’algorithme. Tout d’abord, l’algorithme ne générera pas cercles. Alors que les cellules de Cryptococcus et leurs capsules prennent une morphologie circulaire, il serait difficile d’appliquer cette technique de détection d’objet non circulaire. Deuxièmement, en raison de comment sont détectées les cercles l’algorithme CHT peut détecter les énormes Pseudo-cercles basés sur les bords extérieurs de plusieurs cercles en cluster. Cependant, n’importe quel corps cellulaires dénaturés, pris dans le Pseudo-cercle de peut être facilement détectés et supprimés d’ensembles de données qui en résulte.
Cette technique est destinée à mesurer les capsules polysaccharidiques circulaire des espèces de Cryptococcus basés sur l’encre de Chine microscopie en champ clair ; Bien qu’elle pourrait s’appliquer aux autre contraste basé ses mesures objet circulaire.
Introduction
Cryptococcus neoformans est une levure pathogène trouvée partout dans le monde entier qui est associé à des maladies humaines, principalement dans les populations immunodéprimées. C. neoformans représente surtout une cause importante de décès annuels totales en Afrique subsaharienne à cause de maladies infectieuses1. La principale manifestation clinique infection cryptococcique est une méningo-encéphalite, qui suit l’invasion du système nerveux central par les transports dans les macrophages infectés (manière de cheval de Troie) ou traversée directe de la barrière hémato – encéphalique. C. neoformans exprime plusieurs facteurs de virulence, y compris la possibilité de répliquer à la température du corps humain, l’activité uréasique, mélanisation et formation d’une capsule polysaccharidique2. La capsule de polysaccharide est composée de répéter des glucuronoxylomannan et des polymères glucoronoxylomannangalactan et des fonctions comme une barrière protectrice contre les facteurs tels que le stress environnemental et hôte des réponses immunitaires2.
Bien que la taille de la taille de capsule polysaccharidique cryptococcique n’a pas toujours été associée avec virulence, il y a des preuves que c’est un facteur dans la pathogenèse2,3,4,5, 6,7. Taille de la capsule est associé à la méningite pathologie6, peut affecter la capacité des macrophages pour contrôler l’ infection de Cryptococcus 5et peut causer une perte de virulence si absent8. Donc, Mensurations taille capsule sont communes dans la recherche de cryptocoque, mais il n’y a aucun fieldwide standard pour une méthode de mesure de la capsule.
Actuellement, c. neoformans polysaccharide capsule mesure repose sur des mesures manuelles d’images de microscopie, et les méthodes exactes des acquisitions d’image et de mesure varient selon les laboratoires9,10, 11. Une préoccupation immédiate à cette méthode, c’est que certaines études nécessitent l’acquisition de milliers de mesures individuelles, ce qui rend difficile la maintien de précision et de fiabilité. En outre, même lorsque les résultats sont publiés, il y a souvent une description insuffisante de la méthode de mesure. Nombreuses publications n’expliquent pas comment leurs mesures ont été obtenues, quel plan focal a été utilisé, comment ils ont déterminé le seuil pour l’identification des capsule, si ils utilisaient rayon ou le diamètre, ils ont utilisé une mesure ou était en moyenne de plusieurs, ou d’autres Détails. Certaines publications seul État leur méthode dans le programme qui a été utilisée, par exemple, « Adobe Photoshop CS3 a été utilisé pour mesurer les cellules »11. Ce manque de normalisation et des rapports de détail peut rendre reproductibilité difficile voire impossible. Différences de vue humaine, la luminosité de l’ordinateur, paramètres de microscope, faire glisser l’éclairage et autres facteurs peuvent varier non seulement entre les individus, mais entre les échantillons, alors que les calculs basés sur les rapports des valeurs d’intensité pixel reste constantes et Il y a lieu entre les échantillons. Cette technique a été générée dans le contexte de la fourniture d’une technique normalisée, précise, rapide et simple pour mesurer des tailles de capsules pour un champ dans lequel il n’y avait aucun avant.
Tel que mentionné précédemment, l’algorithme CHT est établie de longue date, et scripts pour détecter automatiquement les cercles ont été écrit avant. Cette méthode améliore dans deux domaines où les autres scripts tomberait courts. Tout d’abord, simplement détecter les cercles ne suffit pas, car avec les cellules cryptococciques deux cercles distincts doivent être constatées par rapport à l’autre. Cette méthode détecte spécifiquement corps cellulaires dans les capsules, établit une distinction entre les deux et effectue des calculs que sur les paires de corps-capsule pertinentes. En second lieu, même lorsque suivant le même protocole, les différents chercheurs finiront avec différents acquis des images. En permettant le contrôle de l’enquêteur sur chaque paramètre d’algorithme, cet outil peut être réglé pour correspondre à un large éventail de méthodes d’acquisition. Il n’y a pas besoin d’un cadre normalisé, objectif, filtre et ainsi de suite.
Cette technique peut être appliquée facilement à toute situation dans laquelle l’enquêteur doit détecter les cercles dans une image qui contraste avec leur fond. Les deux cercles plus légers et plus sombres que leur origine puisse être détectée, compté, mesuré à l’aide de cette technique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques de cette technique sont préparer la diapositive de l’encre de Chine et acquérir les images de microscope. Alors que l’algorithme a été testé avec succès avec une variété de techniques de diapositive et image le protocole recommandé est décrite dans ce manuscrit. La capsule de polysaccharide est détectée basée sur l’exclusion des particules d’encre du domaine de la capsule, puisque ces particules sont trop grosses pour pénétrer dans le réseau de fibrilles de polysaccharide. Ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Anthony Bowen dont diapositives ont été utilisés comme une deuxième comparaison côte-à-côte humaine mais aussi Sabrina Nolan dont diapositives ont été utilisés comme un troisième homme side-by-side et la deuxième comparaison de microscope.
Materials
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22×22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
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