Automatisierte Messung von Cryptococcus Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper
Summary
Dieses Verfahren beschreibt eine automatisierte Batch-Bildprozessor Polysaccharid Kapsel und Körper Radien messen soll. Während ursprünglich für Cryptococcus Neoformans Kapsel Messungen entwickelt, die automatisierte Bildverarbeitung auch auf andere Grundlage Kontrasterkennung kreisförmigen Objekte angewendet werden kann.
Abstract
Diese Technik soll einen konsistente, präzise und überschaubaren Prozess für eine große Anzahl von Polysaccharid Kapsel Messungen zur Verfügung zu stellen.
Zunächst wird eine Schwelle Bild basierend auf Intensitätswerte eindeutig berechnet für jedes Bild generiert. Dann Kreise basierend auf Kontrast zwischen Objekt und Hintergrund mit dem etablierten Kreis Hough-Transformation (CHT)-Algorithmus erkannt. Schließlich erkannten Zelle Kapseln und Einrichtungen sind je nach Zentrum koordiniert und Radius Größe abgestimmt, und Daten werden dem Benutzer in einer überschaubaren Tabelle exportiert.
Die Vorteile dieser Technik sind einfache, aber wichtige. Erstens, weil diese Berechnungen durch einen Algorithmus anstatt ein Mensch Genauigkeit und Zuverlässigkeit erhöht. Es ist kein Rückgang der Genauigkeit oder Zuverlässigkeit unabhängig davon, wie viele Proben analysiert werden. Zweitens stellt dieser Ansatz eine potenzielle Betriebsanweisung für das Cryptococcus -Feld statt der aktuellen Situation wo Kapsel Messung variiert nach Labor je. Drittens manuelle Kapsel Messungen sind langsam und monoton, ermöglicht Automatisierung schnelle Messungen auf große Zahlen von Hefezellen, die wiederum Hochdurchsatz-Datenanalyse und immer leistungsfähigere Statistiken erleichtert.
Die wesentlichen Einschränkungen dieser Technik stammen wie die Algorithmus-Funktionen. Zuerst wird der Algorithmus nur Kreise erzeugen. Während Cryptococcus -Zellen und ihre Kapseln auf eine kreisförmige Morphologie nehmen, wäre es schwierig, diese Technik auf unrunde Objekterkennung anzuwenden. Zweitens wegen wie Kreisen erkannt werden kann der CHT-Algorithmus enorme Pseudo-Kreise, die basierend auf den äußeren Rändern der mehreren gruppierten Kreise erkennen. Jedoch kann jeder falsch Zellkörpern gefangen innerhalb des Pseudo-Kreises leicht erkannt und aus den daraus resultierenden Datensätzen entfernt.
Diese Technik dient zur Messung der kreisförmigen Polysaccharid-Kapseln Cryptococcus Arten basierend auf Tusche Hellfeld Mikroskopieren; Obwohl es auf angewendet werden könnte basiert anderen Kontrast kreisförmiges Objekt Messungen.
Introduction
Cryptococcus Neoformans ist eine Pathogene Hefe gefunden ubiquitär rund um den Globus, der menschliche Krankheit in erster Linie bei immunsupprimierten Populationen zugeordnet ist. C. Neoformans macht vor allem eine wesentliche Ursache der Gesamtzahl der jährlichen Todesfälle im subsaharischen Afrika aufgrund von Infektionskrankheiten1. Die großen klinische Manifestation der Cryptococcus-Infektion ist Meningoenzephalitis, die Invasion des zentralen Nervensystems mit Verkehrsmitteln in infizierten Makrophagen (Trojanisches Pferd Weise) folgt oder direkte Kreuzung der Blut – Hirn-Schranke. C. Neoformans drückt verschiedene Virulenzfaktoren, einschließlich der Fähigkeit, an der Temperatur des menschlichen Körpers, Urease-Aktivität, Melanization und Bildung eines Polysaccharid Kapsel2zu replizieren. Die Polysaccharid-Kapsel besteht aus Glucuronoxylomannan und Glucoronoxylomannangalactan Polymeren und Funktionen als Schutzbarriere gegen Faktoren wie Umweltbelastung und Host Immunantworten2zu wiederholen.
Obwohl die Größe der Cryptococcus Polysaccharid Kapsel nicht konsequent Virulenz zugeordnet wurde, gibt es Hinweise darauf, dass es ein Faktor bei der Pathogenese2,3,4,5, 6,7. Kapsel Größe Meningitis Pathologie6zugeordnet ist, kann Makrophagen Möglichkeit Cryptococcus -Infektion5Steuern beeinflussen und wenn abwesend8Verlust der Virulenz führen kann. Folglich, Kapsel Größenmessungen sind häufig in der Cryptococcus Forschung jedoch gibt es keine Fieldwide für eine Kapsel Messmethode.
Derzeit, C. Neoformans Polysaccharid Kapsel Messung basiert auf manuelle Messungen von Mikroskopie-Bildern, und die genauen Methoden der Übernahmen von Bild und Messung unterschiedlich Labors9,10, 11. Ein unmittelbares Anliegen dieser Methode ist, dass einige Studien den Erwerb von Tausenden von Einzelmessungen, der was die Genauigkeit und Zuverlässigkeit erschwert. Außerdem, auch wenn die Ergebnisse veröffentlicht werden, gibt es oft unzureichende Beschreibung des Messverfahrens. Viele Publikationen nicht erklären, wie ihre Messungen gewonnen wurden, welche Brennebene verwendet wurde, wie sie den Schwellenwert für die Kapsel Identifikation bestimmt, ob sie Radius oder Durchmesser, verwendet, ob sie eine Messung oder im Durchschnitt mehrere oder andere Details. Einige Publikationen einzige Staat ihre Methode als welches Programm verwendet wurde, z. B. “Adobe Photoshop CS3 diente, die Zellen zu messen”11. Dieser Mangel an Standardisierung und reporting-Detail kann Reproduzierbarkeit schwierig wenn nicht gar unmöglich machen. Unterschiede in der menschlichen Sehvermögen, Computer Helligkeit, Mikroskop-Einstellungen, schieben Sie Beleuchtung und andere Faktoren können variieren zwischen Einzelpersonen, aber auch zwischen Proben, während Berechnungen anhand der Kennzahlen der Pixelwerte Intensität konstant bleibt und zwischen Proben anwendbar. Diese Technik wurde im Zusammenhang mit der Bereitstellung einer standardisierten, genauen, schnelle und einfachen Technik um Kapseln Größen für ein Feld zu messen, in denen gab es vorher keine, generiert.
Wie bereits erwähnt der CHT-Algorithmus ist seit langem etablierte und Skripts zur automatischen Erkennung Kreise vor geschrieben worden. Diese Methode verbessert in zwei Bereichen, wo andere Skripte kurz fallen würde. Erstens ist einfach Kreise erkennen nicht genug, da zwei verschiedene Kreise mit Cryptococcus Zellen zueinander erkannt werden müssen. Diese Methode speziell erkennt Zellkörper in Kapseln, unterscheidet zwischen den beiden und Berechnungen nur auf die entsprechenden Körper-Kapsel-Paare. Zweitens erworben auch als Anschluss an das gleiche Protokoll, verschiedenen Forschern mit verschiedenen landet Bilder. Dadurch, dass die Ermittler Kontrolle über jeden Algorithmus-Parameter, kann dieses Tool auf verschiedenste Akquisemethoden angepasst werden. Es gibt keine Notwendigkeit für eine standardisierte Umfang, Zielsetzung, Filter und So weiter.
Diese Technik kann leicht auf jede Situation angewendet werden, in denen der Prüfer Kreise innerhalb eines Bildes, dass Kontrast mit ihrer Herkunft zu erkennen muss. Beide Kreise heller und dunkler als ihre Hintergrund erkannt werden kann, gezählt und gemessen, mit dieser Technik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die entscheidenden Schritte dieser Technik bereiten die Tusche Folie und die Mikroskopbilder zu erwerben. Während der Algorithmus erfolgreich, mit einer Vielzahl von Folie und Bild Techniken getestet wurde wird die empfohlene Protokoll in diesem Manuskript beschrieben. Die Polysaccharid-Kapsel wird erkannt, basierend auf den Ausschluss von Indien Tintenpartikel aus der Domäne der Kapsel, da diese Teilchen zu groß sind, um das Polysaccharid Fibrille Netzwerk eindringen. Tusche Ausgrenzung führt zu einem hellen Kreis a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würden gerne anerkennen, Anthony Bowen deren Folien als einen zweiten menschlichen Side-by-Side-Vergleich dienten als auch Sabrina Nolan deren Folien als dritte menschliche Side-by-Side und zweite Mikroskop Vergleich verwendet wurden.
Materials
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22×22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
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