Cryptococcal प्रजातियों Polysaccharide कैप्सूल और कोशिका शरीर के स्वचालित माप
Summary
इस तकनीक का वर्णन एक स्वचालित बैच छवि प्रोसेसर polysaccharide कैप्सूल और शरीर radii को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया । शुरू में Cryptococcus neoformans कैप्सूल माप के लिए डिज़ाइन किया गया है, जबकि स्वचालित छवि प्रोसेसर भी परिपत्र वस्तुओं का पता लगाने के आधार पर अन्य विपरीत करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Abstract
इस तकनीक का उद्देश्य polysaccharide कैप्सूल माप की बड़ी संख्या के लिए एक सुसंगत, सटीक और प्रबंधनीय प्रक्रिया प्रदान करना है ।
सबसे पहले, एक थ्रेशोल्ड छवि प्रत्येक छवि के लिए अनन्य रूप से परिकलित तीव्रता मानों पर आधारित उत्पन्न होती है. फिर, वृत्त के आधार पर अच्छी तरह से स्थापित सर्कल फिरभी परिवर्तन (सीएचटी) एल्गोरिथ्म का उपयोग कर ऑब्जेक्ट और पृष्ठभूमि के बीच का पता लगाया है । अंत में, पता लगाया सेल कैप्सूल और निकायों केंद्र निर्देशांक और त्रिज्या आकार के अनुसार मिलान कर रहे हैं, और डेटा एक प्रबंधनीय स्प्रेडशीट में उपयोगकर्ता के लिए निर्यात किया जाता है.
इस तकनीक के फायदे सरल लेकिन महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, क्योंकि इन गणना एक एल्गोरिथ्म के बजाय एक मानव दोनों सटीकता और विश्वसनीयता से प्रदर्शन कर रहे है बढ़ रहे हैं । सटीकता या विश्वसनीयता की परवाह किए बिना कितने नमूनों का विश्लेषण कर रहे है में कोई गिरावट नहीं है । दूसरा, यह approach वर्तमान स्थिति के बजाय Cryptococcus फ़ील्ड के लिए संभावित मानक ऑपरेटिंग कार्यविधि स्थापित करता है जहां प्रयोगशाला द्वारा कैप्सूल माप भिंन होता है । तीसरा, यह देखते हुए कि मैनुअल कैप्सूल माप धीमी और नीरस हैं, स्वचालन खमीर कोशिकाओं की बड़ी संख्या पर तेजी से माप की अनुमति देता है कि बारी में उच्च प्रवाह डेटा विश्लेषण और तेजी से शक्तिशाली आंकड़े की सुविधा ।
इस तकनीक की प्रमुख सीमाएं कैसे एल्गोरिथ्म कार्यों से आते हैं । सबसे पहले, एल्गोरिथ्म केवल हलकों पैदा करेगा । जबकि Cryptococcus कोशिकाओं और उनके कैप्सूल एक परिपत्र आकृति विज्ञान पर ले, यह गैर परिपत्र वस्तु का पता लगाने के लिए इस तकनीक को लागू करने के लिए मुश्किल होगा । दूसरा, कैसे हलकों सीएचटी एल्गोरिथ्म का पता लगाया जाता है के कारण भारी छद्म कई संकुल हलकों के बाहरी किनारों के आधार पर हलकों का पता लगा सकते हैं । हालांकि, छद्म चक्र के भीतर पकड़े गए किसी भी प्रतिनिधित्व सेल निकायों आसानी से पता लगाया जा सकता है और परिणामी डेटा सेट से हटा दिया ।
यह तकनीक भारत केे चमकीले मैदान माइक्रोस्कोपी पर आधारित Cryptococcus प्रजातियों के परिपत्र polysaccharide कैप्सूल को मापने के लिए होती है; हालांकि यह अंय विपरीत परिपत्र वस्तु माप आधारित करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
Cryptococcus neoformans एक रोगजनक खमीर दुनिया है कि immunosuppressed आबादी में मुख्य रूप से मानव रोग के साथ जुड़ा हुआ है चारों ओर बैरे पाया है । C. neoformans सबसे विशेष रूप से उप सहारा अफ्रीका में कुल वार्षिक मौतों का एक महत्वपूर्ण कारण के लिए खातों संक्रामक रोग1के कारण । cryptococcal संक्रमण के प्रमुख नैदानिक अभिव्यक्ति meningoencephalitis है, जो संक्रमित मैक्रोफेज में परिवहन द्वारा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के आक्रमण का अनुसरण करता है (ट्रोजन हॉर्स तरीके) या रक्त मस्तिष्क बाधा के प्रत्यक्ष पार । C. neoformans मानव शरीर के तापमान पर दोहराने की क्षमता सहित कई डाह कारकों को व्यक्त करता है, यूरीस गतिविधि, melanization, और एक polysaccharide कैप्सूल2के गठन. polysaccharide कैप्सूल दोहराया glucuronoxylomannan और glucoronoxylomannangalactan पॉलिमर और पर्यावरणीय तनाव और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं2के रूप में कारकों के खिलाफ एक सुरक्षात्मक बाधा के रूप में कार्य के रूप में काम करता है से बना है ।
हालांकि cryptococcal polysaccharide कैप्सूल आकार का आकार लगातार डाह के साथ संबद्ध नहीं किया गया है, वहाँ सबूत है कि यह रोगजनन में एक कारक है2,3,4,5, 6,7. कैप्सूल का आकार दिमागी विकृति6के साथ जुड़ा हुआ है, Cryptococcus संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए macrophage क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं5, और अगर अनुपस्थित8डाह के नुकसान में परिणाम कर सकते हैं. इसलिए, कैप्सूल आकार माप cryptococcal अनुसंधान में आम हैं, लेकिन कैप्सूल माप की एक विधि के लिए कोई fieldwide मानक है.
वर्तमान में, C. neoformans polysaccharide कैप्सूल माप माइक्रोस्कोपी छवियों के मैनुअल माप पर आधारित है, और छवि और माप अधिग्रहण दोनों की सटीक तरीके प्रयोगशालाओं में बदलती हैं9,10, 11. इस विधि के लिए एक तत्काल चिंता का विषय है कि कुछ अध्ययनों से व्यक्तिगत माप है, जो सटीकता और विश्वसनीयता को बनाए रखने मुश्किल बनाता है हजारों के अधिग्रहण की आवश्यकता है । इसके अलावा, जब भी परिणाम प्रकाशित कर रहे हैं, वहां अक्सर माप विधि का अपर्याप्त वर्णन है । कई प्रकाशनों नहीं समझा कैसे उनके माप प्राप्त किए गए, क्या फोकल विमान का इस्तेमाल किया गया था, वे कैप्सूल पहचान के लिए सीमा निर्धारित कैसे, चाहे वे त्रिज्या या व्यास का इस्तेमाल किया, चाहे वे एक माप या औसत कई, या अन्य इस्तेमाल किया विवरण. कुछ प्रकाशनों केवल राज्य उनके विधि के रूप में जो प्रोग्राम इस्तेमाल किया गया था, उदाहरण के लिए, “एडोब फोटोशॉप CS3 कोशिकाओं”11मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था । मानकीकरण और रिपोर्टिंग विस्तार की यह कमी असंभव नहीं तो reproducibility मुश्किल बना सकते हैं । मानव दृष्टि, कंप्यूटर चमक, माइक्रोस्कोप सेटिंग्स, स्लाइड प्रकाश, और अन्य कारकों में अंतर न केवल व्यक्तियों के बीच, लेकिन नमूनों के बीच भिन्न हो सकते हैं, जबकि पिक्सेल तीव्रता मूल्यों के अनुपात के आधार पर गणना लगातार रहेगा और नमूनों के बीच लागू । इस तकनीक को एक मानकीकृत, सटीक, तेजी से प्रदान करने के संदर्भ में उत्पंन किया गया था, और सरल तकनीक के लिए एक क्षेत्र है जिसमें वहां पहले कोई नहीं था के लिए कैप्सूल आकार को मापने ।
के रूप में पहले उल्लेख किया है, सीएचटी एल्गोरिथ्म लंबे समय से स्थापित है, और लिपियों स्वचालित रूप से पता लगाने हलकों से पहले लिखा गया है । इस विधि के दो क्षेत्रों में सुधार जहां अंय लिपियों कम गिर जाएगी । सबसे पहले, बस का पता लगाने हलकों पर्याप्त नहीं है, क्योंकि cryptococcal कोशिकाओं के साथ दो अलग हलकों एक दूसरे के संबंध में पता लगाया जाना चाहिए । इस विधि विशेष रूप से कैप्सूल के भीतर सेल निकायों का पता लगाता है, दोनों के बीच भेदभाव, और केवल प्रासंगिक शरीर कैप्सूल जोड़े पर गणना करता है. दूसरा, यहां तक कि जब एक ही प्रोटोकॉल का पालन, विभिंन जांचकर्ताओं विभिंन अधिग्रहीत छवियों के साथ खत्म हो जाएगा । प्रत्येक एल्गोरिथ्म पैरामीटर पर जांचकर्ता नियंत्रण की अनुमति देकर, इस उपकरण के अधिग्रहण विधियों की एक विस्तृत श्रृंखला से मेल करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । एक मानकीकृत गुंजाइश, उद्देश्य, फिल्टर, और इतने पर के लिए कोई ज़रूरत नहीं है ।
इस तकनीक को आसानी से किसी भी स्थिति में अंवेषक के लिए एक छवि के भीतर हलकों का पता लगाने की जरूरत है कि उनकी पृष्ठभूमि के साथ इसके विपरीत लागू किया जा सकता है । दोनों हलकों हल्का और उनकी पृष्ठभूमि से गहरा पता लगाया जा सकता है, गिना, और इस तकनीक का उपयोग कर मापा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तकनीक के अहम कदम भारत केे स्लाइड तैयार कर रहे हैं और माइक्रोस्कोपी इमेज हासिल कर रहे हैं । एल्गोरिथ्म सफलतापूर्वक स्लाइड और छवि तकनीक की एक किस्म के साथ परीक्षण किया गया है, जबकि अनुशंसित प्रोटोकॉल ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एंथनी Bowen स्वीकार करते है जिसकी स्लाइड के रूप में एक दूसरे मानव के साथ-साथ तुलना के रूप में अच्छी तरह से सबरीना नोलन जिनकी स्लाइड एक तिहाई मानव पक्ष के रूप में इस्तेमाल किया गया था और दूसरा खुर्दबीन तुलना के रूप में इस्तेमाल किया गया ।
Materials
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22×22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
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