Автоматизированное измерение криптококковой видов полисахаридной капсулы и клетки тела
Summary
Этот метод описывает процессор обработки изображений автоматизированный пакет предназначен для измерения полисахаридной капсулы и тело радиусов. Хотя первоначально предназначен для Cryptococcus neoformans капсула измерений процессор автоматизированных изображения также могут применяться для обнаружения других контраста на основе круговой объектов.
Abstract
Этот метод призван обеспечить последовательную, точной и управляемым процесс для большого числа полисахаридной капсулы измерений.
Во-первых порог изображение формируется на основании значений интенсивности, однозначно рассчитывается для каждого изображения. Затем круги обнаруживаются, основанные на контраст между объектом и фоном, с использованием алгоритма устоявшихся преобразование Хафа круг (CHT). Наконец капсулы обнаруженных клетки и органы подобраны согласно Координаты центра и размер радиуса и экспортируются данные для пользователя в таблицу управляемым.
Простой, но значительные преимущества этой методики. Во-первых, потому, что эти расчеты выполняются на алгоритм, вместо того, чтобы человека увеличивается точность и надежность. Существует не снижение точности или надежности независимо от того, сколько пробы анализируются. Во-вторых этот подход устанавливает потенциальных Стандартная операционная процедура для поля Cryptococcus вместо нынешней ситуации, когда капсула измерения зависит от лаборатории. В-третьих учитывая, что ручной капсула измерения медленно и однообразной, Автоматизация позволяет быстрого измерения на большое количество дрожжевых клеток, которые в свою очередь облегчает анализ данных высокой пропускной способности и все более мощные статистики.
Основные ограничения этой методики берутся как функции алгоритма. Во-первых алгоритм будет создавать только круги. В то время как Cryptococcus клетки и их капсулы взять на круговой морфологии, было бы трудно применять этот метод для обнаружения объектов не круглое. Во-вторых благодаря как круги обнаруживаются CHT алгоритм может обнаружить огромные псевдо-круги, основанный на внешних краях нескольких кластерных кругов. Однако любой исказил клеток тела, поймали в псевдо-круг можно легко обнаружены и удалены из результирующих наборов данных.
Этот метод предназначен для измерения круговой полисахаридной капсулы Cryptococcus видов на основе чернил Индии светлые области микроскопии; Хотя он может быть применен к другим контраста на основе круговой объект измерения.
Introduction
Cryptococcus neoformans является патогенных дрожжей, найдены повсеместно в мире, который связан с человеческие заболевания преимущественно в популяциях подавленным иммунитетом. C. neoformans прежде всего приходится существенной причиной общее ежегодное количество смертей в субсахарской Африке вследствие инфекционных болезней1. Основным клиническим проявлением криптококковой инфекции является менингоэнцефалит, который следует вторжения центральной нервной системы на транспорте в зараженные макрофаги (троянский конь образом) или прямые пересечения blood – brain барьер. C. neoformans выражает некоторые факторы вирулентности, включая возможность реплицировать на температуре человеческого тела, активность уреазы, melanization и формирование полисахаридной капсулы2. Полисахаридной капсулы состоит из повторяющихся glucuronoxylomannan и glucoronoxylomannangalactan полимеров и функции как защитный барьер против факторы экологического стресса и иммунной реакции2.
Хотя размер криптококковой полисахаридной капсулы размер последовательно не связывается с вирулентности, есть свидетельства того, что это фактор в патогенезе2,3,,4,5, 6,7. Капсула размер связан с менингитом патологии6, может повлиять на способность макрофагов контролировать Cryptococcus инфекции5и может привести к потере вирулентности если отсутствует8. Таким образом измерения размера капсулы являются общими в криптококковой исследований, но там не fieldwide стандарт для метода капсула измерения.
В настоящее время C. neoformans полисахаридной капсулы измерение основано на ручных измерений микроскопии изображений, и точные методы приобретения изображений и измерение варьируются от лаборатории9,10, 11. Главная задача этого метода является, что некоторые исследования требуют приобретения тысяч отдельных измерений, что затрудняет поддержание точность и надежность. Кроме того даже когда публикуются результаты, есть часто недостаточное описание метода измерения. Многие публикации не объяснить, каким образом были получены их измерения, что фокальной плоскости был использован, как они определены порог для капсула идентификации, ли они использовали радиус или диаметр, ли они использовать одно измерение, или в среднем несколько, или другие детали. Некоторые публикации только состояние их метод как какая программа была использована, например, «Adobe Photoshop CS3 был использован для измерения клетки»11. Такое отсутствие стандартизации и отчетности подробно может сделать воспроизводимость трудно, если не невозможно. Различия в человеческое зрение, компьютер яркости, Микроскоп настройки, слайд освещения, и других факторов может изменяться не только между отдельными лицами, но и между образцы, в то время как расчеты на основе соотношения значений интенсивности пикселей будет оставаться постоянным и применимые между выборками. Эта техника была создана в контексте обеспечения стандартизированной, точной, быстрый и простой способ измерить размеры капсул для поля, в котором не было ни до.
Как упоминалось ранее CHT алгоритм, давно, и сценарии для автоматического обнаружения круги были написаны раньше. Этот метод улучшает в двух областях, где бы не отвечают другие скрипты. Во-первых просто обнаружения круги не достаточно, потому что с криптококковой клетки должны быть обнаружены два различных кругов по отношению друг к другу. Этот метод специально обнаруживает клетки органов внутри капсулы, провести различие между двумя и выполняет вычисления только на соответствующие пары тела капсула. Во-вторых даже когда следующие же протокол, разные исследователи будут в конечном итоге с различными приобретенные изображения. Позволяя контролировать каждый параметр алгоритма следователь, этот инструмент может быть скорректированы в соответствии широкий спектр методов приобретения. Нет необходимости для стандартизированных охвата, цели, фильтра и так далее.
Этот метод легко может применяться к любой ситуации, в которой следователь должен обнаружить круги в изображении что контраст с их фоне. Как круги светлее и темнее, чем их фона могут быть обнаружены, подсчет и измерить, используя эту технику.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги этой методики подготовки слайд чернил Индии и приобретение микроскопа изображений. Хотя алгоритм успешно протестирована с различных методов слайд и изображения рекомендуемый Протокол описан в этой рукописи. Полисахаридной капсулы обнаруживается, основанные на искл…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы признать Энтони Боуэн, чьи слайды были использованы в качестве второго человека бок о бок сравнения, а также Sabrina Нолан, чьи слайды были использованы в качестве третьего человека бок о бок и второй Микроскоп сравнения.
Materials
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22×22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).
- Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), 007 (2013).
- Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Araujo, G. d. e. S., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).
- García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
- Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
- Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
