Automatiserad mätning av Cryptococcal arter polysackarid kapsel och cellkroppen
Summary
Denna teknik beskriver en automatiserad batch bildprocessor avsedd att mäta polysackarid kapsel och kroppen radier. Samtidigt som ursprungligen har utformats för Cryptococcus neoformans kapsel mätningar automatiserade bildprocessorn kan också tillämpas på andra baserat kontrastmätning av cirkulära objekt.
Abstract
Syftet med denna teknik är att ge en konsekvent, korrekt och hanterbar process för ett stort antal polysackarid kapsel mätningar.
Först, en tröskel bilden genereras baserat på intensitetsvärden unikt beräknas för varje bild. Sedan, cirklar upptäcks baserat på kontrasten mellan objekt och bakgrund med väletablerade cirkel Hough Transformation (CHT) algoritm. Slutligen de upptäckta cell kapslar och organ matchas enligt center koordinater och RADIUS-storlek och data exporteras till användaren i ett lätthanterligt kalkylblad.
Fördelarna med denna teknik är enkel men betydande. Första, eftersom dessa beräkningar utförs av en algoritm i stället för en människa både noggrannhet och tillförlitlighet ökar. Det finns ingen nedgång i riktigheten eller tillförlitligheten oavsett hur många prover analyseras. För det andra, denna strategi fastställs en potentiell normalförfarande för fältet Cryptococcus i stället för den nuvarande situationen där kapsel mätning varierar av lab. Tredje, med tanke på att manuell kapsel mätningar är långsam och monotona, automation tillåter snabba mätningar på stora mängder jästceller som i sin tur underlättar hög genomströmning dataanalys och allt mäktigare statistik.
Stora begränsningar i denna teknik kommer från hur funktionerna algoritm. Algoritmen kommer först, bara generera cirklar. Medan Cryptococcus celler och deras kapslar tar på en cirkulär morfologi, skulle det vara svårt att tillämpa denna teknik till icke-cirkulära objekt upptäckt. För det andra, på grund av hur cirklar upptäcks CHT algoritmen kan upptäcka enorma pseudo cirklar baserat på ytterkanterna på flera klustrade cirklar. Dock kan någon felaktig bild cell organ som fångas inom pseudo cirkeln enkelt upptäckas och tas bort från de resulterande datauppsättningarna.
Denna teknik är avsedd för mätning av cirkulär polysackarid kapslarna av Cryptococcus arter baserat på India färgpulver ljusa fält mikroskopi; Trots det skulle kunna tillämpas på bygger andra kontrast cirkulär objektet mätningar.
Introduction
Cryptococcus neoformans är en patogen jäst hittade ubiquitously i världen som är associerad med mänskliga sjukdomen primärt hos immunsupprimerade populationer. C. neoformans framför står för en betydande orsak till totala årliga dödsfall i subsahariska Afrika på grund av smittsam sjukdom1. Den stora kliniska manifestationen av cryptococcal infektion är meningoencefalit, som följer invasion av centrala nervsystemet av transport i infekterade makrofagerna (trojansk häst sätt) eller direkt korsning av den blod – hjärnbarriären. C. neoformans uttrycker flera virulensfaktorer inklusive möjligheten att replikera på människans kroppstemperatur, ureasaktivitet, melanization och bildandet av en polysackarid kapsel2. Polysackarid kapseln består av upprepade glucuronoxylomannan och glucoronoxylomannangalactan polymerer och funktioner som en skyddande barriär mot faktorer som stress och värd immunsvar2.
Även om storleken på cryptococcal polysackarid kapsel storlek inte konsekvent har associerade med virulens, finns det bevis för att det är en faktor i patogenesen2,3,4,5, 6,7. Storlek är associerad med meningit patologi6, kan påverka makrofag förmåga att styra Cryptococcus infektion5och kan resultera i förlust av virulens om frånvarande8. Därför kapsel storlek mätningar är vanliga i cryptococcal forskning, men det finns ingen fieldwide standard för en kapsel mätmetod.
För närvarande C. neoformans polysackarid kapsel mätningen baseras på manuella mätningar av mikroskopi bilder, och metoderna för både bild och mätning förvärv varierar mellan laboratorier9,10, 11. En omedelbar oro att denna metod är att vissa studier kräver förvärvet av tusentals enskilda mätningar, vilket försvårar att upprätthålla noggrannhet och tillförlitlighet. Dessutom även när resultaten publiceras, finns det ofta otillräcklig Beskrivning av mätmetoden. Många publikationer inte förklara hur deras mätningar erhölls, vilken fokalplan användes, hur de beslutsamma tröskeln för kapsel identifiering, huruvida de använt radie eller diameter, oavsett om de används en mätning eller i genomsnitt flera, eller andra Detaljer. Vissa publikationer endast staten deras metod som vilket program som använts, t.ex., ”Adobe Photoshop CS3 användes för att mäta cellerna”11. Denna brist på standardisering och rapportering detalj kan göra reproducerbarhet svårt om inte omöjligt. Skillnader i människors syn, dator ljusstyrka, Mikroskop inställningar, Skjut belysning och andra faktorer kan varierar inte bara mellan individer utan mellan prover, medan beräkningar baserade på förhållanden av pixel intensitetsvärden förblir konstant och tillämpliga mellan prover. Denna teknik har genererats i samband med att tillhandahålla en standardiserad, korrekt, snabb och enkel teknik för att mäta kapslar storlekar för ett fält där det fanns ingen innan.
Som tidigare nämnts, CHT algoritmen är väletablerad och skript för att automatiskt upptäcka cirklar har skrivits innan. Metoden förbättrar i två områden där andra skript skulle falla kort. Första helt enkelt upptäcka cirklar är inte tillräckligt, eftersom med cryptococcal celler två distinkta cirklar måste upptäckas i förhållande till varandra. Denna metod uttryckligen upptäcker cellen organ inom kapslar, diskriminerar mellan två och utför beräkningar endast på de relevanta organ-kapsel-par. För det andra, även när efter samma protokoll, olika utredare kommer att sluta med olika förvärvade bilder. Genom att låta försöksledaren kontroll över varje algoritm parametern, kan detta verktyg justeras för att passa ett brett spektrum av förvärvsmetoder. Det finns inget behov av en standardiserad omfattning, mål, filter och så vidare.
Denna teknik kan lätt tillämpas på varje situation där utredaren behöver upptäcka cirklar inom en bild som kontrast till deras bakgrund. Både cirklar ljusare och mörkare än deras bakgrund kan upptäckas, räknas och mäts med hjälp av denna teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritiska steg med denna teknik förbereder i India färgpulver bilden och förvärva Mikroskop bilderna. Medan algoritmen har framgångsrikt testats med en mängd olika bild och bild tekniker beskrivs rekommenderade protokollet i detta manuskript. Polysackarid kapseln upptäcks baserat på uteslutandet av Indien bläckpartiklar från domänen för kapseln som dessa partiklar är för stora för att tränga igenom polysackarid fibrill nätverket. India färgpulver utslagning resulterar i en ljus cirkel ovanpå en mörk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi skulle vilja erkänna Anthony Bowen vars bilder användes som andra mänskliga sida-vid-sida jämförelse samt Sabrina Nolan vars bilder användes som en tredje mänskliga sida-vid-sida och andra Mikroskop jämförelse.
Materials
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22×22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).
- Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), 007 (2013).
- Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Araujo, G. d. e. S., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).
- García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
- Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
- Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
