Målrettet genomet redigering i modellen systemet Danio rerio (sebrafisk) har blitt mye lettere av fremveksten av CRISPR tilnærminger. Her beskriver vi en strømlinjeformet og robust protokoll for generasjon og identifisering av CRISPR-avledet tull alleler som inkorporerer heteroduplex mobilitet analysen og identifikasjon av mutasjoner med neste generasjons sekvensering.
Karakterisering av de klynget, interspaced regelmessig, kort, palindromic gjenta (CRISPR) system for Streptococcus pyogenes har aktivert utviklingen av en tilpasses plattform å raskt generere genet endringer i en rekke organismer, inkludert sebrafisk. CRISPR-baserte genomet redigering bruker en enkelt hjelpelinje RNA (sgRNA) å målrette en CRISPR-assosiert (Cas) endonuclease for en genomisk DNA (gDNA) mål av interesse, der Cas-endonuclease genererer en dobbel-strand pause (DSB). Reparasjon av DSBs av feilutsatte mekanismer føre til innsettinger og/eller slettinger (indeler). Dette kan forårsake frameshift mutasjoner som ofte introduserer en tidlig stopp codon innen koding sekvensen, dermed skape en protein-null allelet. CRISPR-baserte genomet krever bare noen molekylær komponenter og er lett introdusert i sebrafisk embryo ved microinjection. Denne protokollen beskriver metodene som brukes til å generere CRISPR reagensene sebrafisk microinjection og identifisere fisk viser germline overføring av CRISPR endret gener. Disse metodene omfatter i vitro transkripsjon av sgRNAs, microinjection CRISPR reagenser, identifikasjon av indeler indusert på målområdet bruker PCR-basert metode kalt en heteroduplex mobilitet analysen (HMA) og karakterisering av indeler bruke både lav overføringshastighet og en kraftig neste generasjons sekvensering (NGS)-tilnærming som kan analysere flere PCR produkter fra heterozygote fisk. Denne protokollen er strømlinjeformet for å redusere både antall fisk kreves og typer utstyr som trengs for å utføre analysene. Videre er denne protokollen utformet for å være mottagelig for bruk av laboratoriet personlig på alle nivåer av erfaring inkluderer studenter, slik at dette kraftige verktøyet å økonomisk noen forskningsgruppe interessert i å utføre CRISPR-basert genomic endring i sebrafisk.
Bevaring av molekylære maskiner over eukaryoter ligger under kraften i å bruke modellen organismer for forskning. Mange av disse modellsystemer rette for bruk av reverse-genetiske tilnærminger som målrettet genet fortrenging å karakterisere bidrag gene produktet til en biologisk eller sykdom prosess av interesse. Gene avbrudd teknikker i organismer som sebrafisk avhengig historisk målrettet innføring av frameshift mutasjoner som følge av upresise reparasjon av DSBs1,2. Når en DSB er introdusert i genomet, DNA lesjonen er reparert gjennom en av to baner som er universelt i nesten alle celletyper og organismer: ikke-homologe slutten med (NHEJ) og homologi-rettet reparasjon (HDR)3,4 . Upresise natur NHEJ maskiner produserer ofte indeler ulike lengder5,6,7,8,9. Innføring av frameshift mutasjoner i et gen koding spørsmålsrekken kan produsere en tidlig stopp codon, som ofte gjør genet fungerer ikke.
Tidlig genomet engineering strategier i sebrafisk å fremme indeler inkludert meganucleases, sink-finger nucleases og transkripsjon aktivator som effektor nucleases, som utnyttet DNA-protein interaksjoner å målrette en nuclease til en bestemt genomisk mål hvor det introdusert en DSB10,11,12,13,14,15. Disse teknologiene er imidlertid ofte vanskelig å bruke på grunn av arbeidskrevende og komplekse prosjektering kreves for å generere en nuclease mål DNA sekvensen av interesse. I motsetning til tidligere strategier stole CRISPR-baserte genet redigering ikke på protein-DNA samhandlinger for målretting. I stedet styres CRISPR-assosiert (Cas) endonuclease via en RNA guide som bruker nukleotid base sammenkobling interaksjoner for å målrette en genomisk området rundt16,17,18,19 ,20,21. På grunn av enkelheten med å utforme en RNA er guide med ønsket base sammenkobling samhandlinger for målretting det relativt enkelt å målrette Cas-endonuclease til ønsket locus. Type II CRISPR system er spesielt mye utviklet for genomet redigering programmer på grunn av flere fordelaktig funksjoner inkludert bruk av en enkelt replikasjonen Cas-nuclease (Cas9) som krever interaksjon med DNA å stimulere endonuclease aktivitet og bruk av en enkelt hjelpelinje (sgRNA) for å målet til beslektet DNA sekvens18. Sekvensen kravene nødvendig for målretting av beslektet sgRNA er godt forstått19, og den ønskede sgRNA genereres lett i vitro transkripsjon. Enkelhet og robusthet av CRISPR/Cas9 tilnærming forenkler sterkt målrettet genmodifisering i sebrafisk og en rekke andre organismer.
Forbedret evne til å gjennomføre målrettet genomet redigering i sebrafisk som følge av utviklingen av CRISPR-baserte reagenser har økt mulighet til å studere prosesser illustrerende for virveldyrenes organismer som utviklingen av sentralnervesystemet system. Sebrafisk genomet inneholder orthologs av 70% av protein-koding gener i det menneskelige genom samt 84% av gener som er knyttet til sykdommer i mennesker22. Sebrafisk utviklingen viser flere nøkkel egenskaper som forbedrer bruken i omvendt genetiske studier: embryoene legges i store klør, utvikle eksternt fra mor gjør dem mottakelig for genetisk manipulering av microinjection og voksen sebrafisk seksuelt moden med 3 måneder gammel, slik at for rask spredning ønskede linjene23.
Flere protokoller er tilgjengelige som beskriver en rekke tilnærminger til å generere og identifisere CRISPR-avledet indeler i sebrafisk24,25,26,27,28,29 ,30,31. Men mange av disse prosedyrene er intens, krever tilgang til dyrt utstyr, og kan være utfordrende for labs med begrenset ekspertise. Trinnene beskrevet her gir en enkel, robust og økonomisk CRISPR/Cas9-strategi til ingeniør sebrafisk knockout linjer. Denne protokollen beskriver bruken av en svært effektiv kit å syntetisere sgRNAs bruker DNA oligonucleotides (oligos), som ligner andre tilnærminger som er beskrevet tidligere32. Beskrevet protokollen omfatter to trinn spesielt som sterkt forenkler analyse av CRISPR-mutert linjer: step-by-step bruk PCR-baserte HMA33 til enkelt å se tilstedeværelsen av Genova endringer og sekvensering analyse av heterozygote sebrafisk til raskt og enkelt angi flere indeler på en økonomisk måte. I tillegg er instruksjoner inkludert for robust utvalg, pålitelig produksjon og injeksjon av guide RNAs. Trinnene her eksemplifiserer en robuste, relativt billig protokoll som laboratoriepersonell med en rekke kompetanse å bidra til identifisering av genet knockouts i sebrafisk.
Denne protokollen beskriver produksjon av genet knockouts i sebrafisk virveldyr modell systemet bruker CRISPR-Cas9-teknologi. Flere protokoller har tidligere blitt beskrevet for å gjennomføre CRISPR-mediert genomet engineering i sebrafisk15,25,26,50,51,52. Denne protokollen bygger på tidligere innsats ved å kombinere en rekke enkle men reproduserbar konsekvent eksperimentelle teknikker, spesielt HMA og NGS av flere heterozygote fisk, lage en enkel, økonomisk, og eksperimentelt robust protokollen for CRISPR-mediert mutagenese i sebrafisk som passer for labs bemannet med personell med et utvalg av opplæring og erfaring, samt undervisning labs.
Anbefalinger for design og syntese av guide RNAs er inkludert i denne protokollen. En viktig faktor i guide RNA design er minimering av off-målet effekter. Flere prediksjon algoritmer er utviklet for å tillate CRISPR-brukere tilgang til beregning verktøy med brukervennlige grafiske grensesnitt som spår både aktiviteten på målet guide og sjansen for off-målet effekter34, 35,36. En bestemt fordel av sebrafisk er reduserte priser off-målet effekter fordi Cas9 injiseres i embryoene og derfor uttrykket er forbigående, som har vært vist i mus resulterer i redusert off-målet effekter53. Off-målet effekter har likevel vist seg for å oppstå i sebrafisk54. En måte å kontrollere for off-målet effekter er å fenotypen grunnlegger sebrafisk som er generert av to uavhengig guide RNAs som er rettet mot det samme genet, som disse guidene vil være svært sannsynlig til å påvirke forskjellige off-målet områder. En annen metode å minimere off-målet effekter ikke er beskrevet i denne protokollen er bruken av et mutert Cas9 som genererer enkelt strand bryter på målet DNA, som er reparert med høy effektivitet. Sammenkobling DNA kutt i nærheten av hverandre som er komplementære til motsatt tråder gir effektiv indel formasjon på ønsket locus og minimerer off-målet effekter55,56.
I tillegg til ulike priser off-målet effekter, kan forskjellige sgRNAs ha ulike priser over mutagenese ønskede mål57,58,59. Denne protokollen bruker HMA for å analysere effektiviteten av mutagenese av en gitt sgRNA bruker heteroduplex band formasjon33,40. Heteroduplex band opprettes ved blanding av PCR-generert DNA tilnærmingene som inneholder uoverensstemmelser, og kan lett løses med gel geleelektroforese. I motsetning til andre metoder som vanligvis brukes til å måle indel formasjon, som T7 endonuclease analysen eller høy oppløsning smelte analyse25,26, HMA krever ikke et dyrt enzym å kutte DNA, og krever ikke komplisert analyse av PCR smelte kurver. Viktigere, bruker HMA kontrollere høy forekomst av indel formasjon i befolkningen injisert kan også etterforskeren å minimere antallet av fisk nødvendig for etterfølgende produksjon av banke-ut linjer, noe som reduserer kostnadene ved å identifisere en mutasjon med den ønsket kjennetegnene.
Det er relative enkelt å generere CRISPR-baserte indeler gjør etablering av flere alleler av flere gener samtidig. Web-basert programvare er tilgjengelig for analyse av enkelt mutasjoner fra heterozygote fisker med Sanger sekvensering av PCR produkter49. I tilfelle der tre eller flere CRISPR-mutert alleler analyseres er NGS å karakterisere indel natur sannsynlig å være mer kostnadseffektivt å karakterisere natur indel som denne tilnærmingen lar en pool av opptil 50 forskjellige alleler å være preget på o NCE (se Tabell for materiale)60,61,62. Slike økonomien i skala ville trolig være spesielt nyttig i et lavere laboratorium.
I sammendraget, denne protokollen gir trinnvise instruksjoner om reproduserbar genererer høy kvalitet CRISPR-reagenser (spesielt sgRNA) slik at færre voksne fisk må opprettes og analysert for å kunne identifisere de muterte alleler interessepunkter, som også reduserer tid og kostnader å generere ønskede linjene. Viktigere, er denne protokollen utformet slik at det kan brukes av laboratorier med begrensede ressurser til å produsere mutant sebrafisk på en rimelig måte. Videre har vi funnet at denne tilnærmingen er egnet for studenter og dermed utvider mulighetene for utdanning og opplæring av studentene interessert i praktisk erfaring innen CRISPR-baserte genomet redigering.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R21CA182197 til J.O.), Ralph W. og Grace M. Showalter forskning tillit, og ved Purdue landbruksvitenskap og utvidelse for økonomisk utvikling (AgSEED) programmet. Sanger sekvensering data ble kjøpt opp av funksjonen Purdue Genomics Core støttes av P30 CA023168. Mary Witucki ble støttet av Purdue University Center for Cancer Research sommer Undergraduate Research Program støttes av Carroll County Cancer Association. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker Benjamin Carter, Ellen Denning og Taylor Sabato for å gi tilbakemelding på manuskriptet. Vi takker Institutt for biokjemi for støtte av dette arbeidet, og Center for sebrafisk forskning ved Purdue University for deres engasjement i pleie og velferd for våre sebrafisk koloni. Til slutt, vi takker Purdue Genomics Core anlegget, og bidrag av Phillip San Miguel angående NGS tjenestene.
CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |