종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

요약

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

초록

히스톤 수정은 epigenome의 주요 구성 요소를 구성 하며 중요 한 역할을 규제 관련된 loci의 transcriptional 상태를 결정 합니다. 또한, 특정 수정의 존재 위치와 강화 등 비 코딩 기능 요소 정체성을 결정 하 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, chromatin immunoprecipitation 다음 세대 시퀀싱 (칩 seq) 다음 개별 히스톤 수정의 게놈 넓은 프로필 결정에 강력한 도구가 되고있다. 그러나, 그것은 점점 더 분명 chromatin 수정, Chromatin 상태 라고의 조합 패턴 정체성과 관련 된 genomic 소재 시의 결정 되고있다. 따라서, 다양 한 전산 분석 파이프라인 수 뿐만 아니라 히스톤 수정 표시를 프로 파일링에 대 한 강력한 높은 처리량 (HT) 방법론의 구성 된 워크플로 처리 칩 Seq의 무수의 프로 파일링 데이터 집합에 필요한 샘플의 많은 수에 있는 epigenomic 국가의 포괄적인 결정. 여기는 HT 칩 Seq 워크플로 두 개의 모듈로 구성: 1) 적은 양의 종양 샘플 및 96-잘 형식; 셀 라인에서 여러 히스톤 수정 프로 파일링 실험 프로토콜 그리고 2) 개별 마크 인 및 조합 chromatin 상태 패턴을 계산 하는 기존 도구를 결합 하 여 전산 데이터 분석 파이프라인. 함께,이 두 가지 모듈 쉽게 처리 칩 Seq 샘플의 수백의 신속 하 고 효율적인 방식으로 촉진 한다. 여기에 제시 된 워크플로 chromatin 상태 패턴 흑색 종 종양 세포에서 6 히스톤 마크 프로필에서 파생 하는 데 사용 됩니다. 전반적으로, 우리는 인간의 종양 샘플 및 다양 한 악성 종양에 epigenomic 착오를 결정 하기 위해 암 세포 라인에 적용할 수 있는 포괄적인 칩 seq 워크플로 제시.

서론

포유류 게놈 (98-99%)의 대다수는 noncoding 시퀀스, 구성 그리고 알려진 유전자 발현 및 염색 질 조직^1,2에 참여 하는 규제 요소를 포함 하는이 nocoding 지역. 정상 세포에서 게놈 DNA의 특정 어셈블리 압축된 chromatin 구조에이 공간 조직, 규정 및 다양 한 DNA 관련 된 프로세스^3,,45의 정확한 타이밍에 대 한 중요 합니다. 그러나 암 세포에, chromatin 수정 후 성적인 탈 선 메커니즘에 의해 chromatin 구조, 규제 요소, 염색체 루핑 시스템 및 유전자 표현 패턴^{6에 대 한 액세스를 포함 하 여 부적절 한 조직에 발생할 수 있습니다. 7,8,,910}.

프로토콜

모든 임상 표본은 기관 검토 위원회의 지침에 따라 얻은 했다.

1. 버퍼 준비

1. TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 10 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 8.0) 200 mL를 확인 합니다.
2. STE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl) 200 mL를 확인 합니다.
3. 2.0 M 글리신 (37.52 g 물 200 mL에 글리신의)의 200 mL 고 65 ° c 열
4. 200 mL의 5% 나트륨 deoxycholate (DOC) 솔루션 물 200 mL에 DOC (10 g)을 확인 합니다.
5. 500 mL 칩 수확 버퍼 (12 mM Tris-Cl, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), 6 mM EDTA, 0.5% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) x 0.1)을 확인 합니다.
6. 칩 희석 버퍼의 500 mL 확인 (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0.1% 의사, 1% 트라이 톤-X, 1 mM EDTA).
7. RIPA 워시 버퍼의 500 mL 확인 (인 트, 1% 트라이 톤 x-100, 0.1 %SDS, 0.1 %DOC).

결과

이 프로토콜에는 냉동된 종양 조직 및 높은 처리량 방법 (그림 1A)를사용 하 여 병렬로 샘플의 수십에 수행할 수 있는 셀 라인에서 immunoprecipitation 수 있습니다. 염색 질 조각을 위한 최적의 immunoprecipitation ~ 200-1000 bps 사이 범위 해야 합니다. 우리는 같은 전단 길이 달성 하는 데 필요한 시간이 다른 조직 및 세포 유형에 대 한 다른 지적 했다. 적은 양의 조직에서 칩의 성공 특히 쥡니다 동안 항상 lysate 감기 유지에 따라 달라 집니다. 순화 칩 DN 사들이 도서관 준비 (그림 2A)를 진행 하기 전에 측정할 수 있습니다. 완성 된 라이브러리 멀티플렉싱 및 NGS 적합 해야 ~ 200-600 bp 사이 고 어떤 뇌관 이합체 없는 (

토론

이 프로토콜 chromatin 주에서 인간의 종양 조직 및 세포의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 높은 처리량 칩 seq 모듈을 설명합니다. 어떤 칩 seq 프로토콜에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 특이성입니다. 여기,이 메서드는 설명된 6 히스톤 수정, 모두 칩 등급 및 이전에 우리와 다른 실험실^42,,4445 에 검증에 대 한 immunoprecipitation 조건 설명 . 동일한 항 체 농도 다른 다양 한 종양 종류에 성공적으로 적용 된, 하는 동안 그것은 관심²⁷의 다른 요소를 공부 하는 경우 항 체 특이성을 결정 하는 중요 한.

성공적인 실험에 대 한 또 다른 주요 측면 쥡니다 조건의 최적화를 포함 한다. 쥡니다 시간과 샘플 및 조직 유형 사.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ChIP 등급 H3K4me1 항체	Abcam	ab8895
ChIP 등급 H3K27ac 항체	Abcam	ab4729
ChIP 등급 H3K4me3 항체	Abcam	ab8580
ChIP 등급 H3K79me2 항체	Abcam	ab3594
ChIP 등급 H3K27me3 항체	Abcam	ab6002
ChIP 등급 H3K9me3 항체	Abcam	ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0	Teknova	T1080
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
글리신	Sigma-Aldrich	G8898
나트륨 deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
DPBS	Sigma - 생명 과학	D8537-500ML
SDS	시그마-알드리치	74255
트리톤-X	시그마-알드리치	X100-100ML
LiCl	시그마-알드리치	746460
NP-40	Calbiochem	492016-100ML
1% TWEEN-20	Fisher Bioreagents	BP337-500
BSA - IgG-free	Sigma - 생명 Sciences	A2058-5G
HBSS	Gibo	14025092
GentleMACS C 튜브	GentleMACS	120-008-466	분리 튜브
16% 포름알데히드	Peierce	28906
miniProtease 억제제	Roche Diagnostics	11836153001	프로테아제 억제제 정제
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10009D
Bioruptor NGS 튜브 0.65 mL	Diagenode	C30010011	초음파 처리 튜브
DynaMag - 96 Side Skirted	Invitrogen	120.27	96-well magnetic stand
TE buffer	Promega	V6231
RNase A	Invitrogen	12091021
Proteinase K	Invitrogen	100005393
AMPure XP 비드	Beckman Coulter	A63882	상자성 비드
에탄올	Sigma-Aldrich	E7023
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로딩 팁, 10 pk	Agilent Technologies	5067-5599
IKA MS3 와류	IKA	3617000	와류

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