שיטה של מטוסי אף-16 יישוב רצף של דגימות חלב
Summary
זרימת עבודה אוטומטית למחצה מוצג עבור רצף יישוב של rRNA מטוסי אף-16 מ חלב וסוגים אחרים של הדגימה נמוך-ביומסה.
Abstract
מחקרים של קהילות מיקרוביאלי הפכו נרחבת עם הפיתוח של רצפי התפוקה יחסית זול, מהיר וגבוה. עם זאת, כמו עם כל הטכנולוגיות הללו, תוצאות לשחזור תלויות שזרימת עבודה במעבדה משלבת אמצעי הזהירות המתאימים ופקדים. דבר זה חשוב במיוחד עם דגימות נמוך-ביומסה איפה לזיהום חיידקי ה-DNA ניתן להפיק תוצאות מטעות. מאמר זה מפרט זרימת עבודה אוטומטית למחצה כדי לזהות חיידקים מדגימות חלב בשד האנושי באמצעות רצף יישוב של אזור V4 ribosomal RNA (rRNA) 16 בסולם נמוך – עד אמצע – throughput. הפרוטוקול מתאר הכנת הדוגמא של חלב מלא כולל: לטעום פירוק, חילוץ חומצת גרעין, הגברה של אזור V4 של מטוסי אף-16 rRNA ג’ין, וכן ספריית הכנה עם אמצעי בקרה. חשוב, הפרוטוקול ואת הדיון לשקול סוגיות שאינן בולטות הכנה, ניתוח דוגמאות נמוך-ביומסה לרבות הפקדים המתאימים חיוביים ושליליים, הסרת המעכב PCR, דוגמת זיהום על ידי הסביבה, מגיב, או מקורות ניסיוני, ושיטות עבודה מומלצות ניסיוני, שנועדו להבטיח הפארמצבטית. בעוד הפרוטוקול כפי שמתואר ספיציפית דגימות חלב, זה יכולת הסתגלות רבים סוגי דגימה ביומסה נמוכה ולא גבוהה, כולל דוגמאות שנאספו על דגימות, קפוא מסודר, או התייצב במאגר שימור.
Introduction
הקהילות אותן מיקרוביאלי לישוב בני האדם מאמינים כי חשובה ביותר לבריאות האדם ומחלות המשפיעים על חילוף החומרים, פיתוח המערכת החיסונית, נטייה למחלות, תגובות חיסון התרופות, טיפול1, 2. מאמצים כדי להבין את השפעת microbiota על בריאות האדם כיום מדגישים את הזיהוי של מיקרובים המשויכות מוגדרים תאים אנטומיים (כלומר, עור, בטן, אוראלי, וכו ‘), כמו גם אתרי מקומי בתוך אלה3,תאים4. המאמצים האלה החקירות לגורם המרכזי עליו מושתתת היא התפתחותה המהירה של נגישות מוגברת של טכנולוגיות הדור הבא רצפי (הגדרות) המספקים פלטפורמה בנפט במקביל לניתוח של התוכן הגנטי מיקרוביאלית (microbiome) של מדגם. לדוגמאות פיזיולוגיים רבים, microbiome המשויך הוא מורכב וגם בשפע (קרי, צואה), אבל עבור כמה דוגמאות, microbiome מיוצג על-ידי ביומסה מיקרוביאלית נמוך (כלומר, חלב, מערכת הנשימה התחתונה) שבו רגישות, חפצי אמנות ניסויית, זיהום אפשרי להפוך את הנושאים העיקריים. האתגרים המשותפים של microbiome לימודי עיצוב ניסיוני המתאים כבר הנושא של מספר סקירת מאמרים5,6,7,8.
שהוצגו במסמך זה צינור ניסיוני חזק המיתרים מבוסס על רצף יישוב של rRNA 16 שכבת ביטול v4 של אזור9 כדי לאפיין את microbiome של חלב. ניתוח Microbiome של חלב אינו מורכב רק על ידי נמוך מטבעו ביומסה מיקרוביאלית של10, אך בנוסף על ידי גבוהה רמות של דנ א אנושי רקע11,12,13,14 ו דחויים פוטנציאלי של PCR מעכבי15,16 בחומצות שחולצו. פרוטוקול זה מסתמך על ערכות חילוץ זמינים מסחרית, פלטפורמות חצי אוטומטיים כדי לסייע במזעור השתנות לאורך אצוות הכנת המדגם. הוא כולל קהילה מדומה חיידקי מוגדרים היטב, שמעובד לצד דוגמאות כמו בקרת איכות כדי לאמת כל שלב בפרוטוקול ולספק מדד עצמאית של צינור חוסן. אמנם הפרוטוקול כפי שתואר ספיציפית דגימות חלב, ניתנת להתאמה בקלות סוגים אחרים דוגמת כולל צואה, בפי הטבעת, בנרתיק, עור, מטליות מונטגומרי, אוראלי10,17, והוא יכול לשמש נקודת מוצא חוקרים המעוניינים לבצע ניתוח microbiome.
Protocol
Representative Results
Discussion
רצף יישוב הדור הבא של מטוסי אף-16 rRNA היא טכניקה בשימוש נרחב, מהיר microbiome אפיון18. עם זאת, גורמים רבים, כולל אפקטים אצווה, זיהום סביבתי, זיהום, לדוגמה, רגישות הפארמצבטית יכול להשפיע לרעה להשפיע על תוצאות הניסוי, וחיסול7,שלהם פרשנות19 , 20<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות Helty Adisetiyo, PhD, Shangxin יאנג, PhD לפיתוח של הפרוטוקול. הכוללת תמיכה עבור הבינלאומי אימהי בילדים מתבגרים איידס קליניים ניסויים קבוצה (IMPAACT) סופק על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של במכון הלאומי של בריאות (NIH) תחת מספרי פרס UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC), UM1AI106716 (IMPAACT LC), עם השתתפות במימון המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר של ובריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD), את נבחרת המכון לבריאות הנפש (NIMH). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של NIH.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
References
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
- Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
- Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
- Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
- Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
- Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
- Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
- Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
- Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
- Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
- Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
- Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
- Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
- Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
- Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
- Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
- Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
- Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
- Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
- Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
- Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
- . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)
