मानव दूध नमूनों की लक्षित 16S अनुक्रमण के लिए एक विधि
Summary
एक अर्द्ध स्वचालित कार्यप्रवाह मानव दूध और अन्य कम बायोमास नमूना प्रकार से 16S rRNA के लक्षित अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत किया है ।
Abstract
माइक्रोबियल समुदायों के अध्ययन अपेक्षाकृत सस्ती, तेजी से, और उच्च प्रवाह अनुक्रमण के विकास के साथ बड़े पैमाने पर हो गए हैं । हालांकि, इन सभी तकनीकों के साथ के रूप में, reproducible परिणाम एक प्रयोगशाला कार्यप्रवाह है कि उचित सावधानियों और नियंत्रण को शामिल पर निर्भर करते हैं । यह कम बायोमास के नमूनों के साथ विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां बैक्टीरिया का डीएनए भ्रामक परिणाम उत्पन्न कर सकता है । यह लेख एक अर्द्ध स्वचालित कार्यप्रवाह 16S राइबोसोमल आरएनए (rRNA) V4 क्षेत्र के लक्षित अनुक्रमण का उपयोग कर मानव स्तन दूध नमूनों से रोगाणुओं की पहचान करने के लिए एक कम-मध्य प्रवाह पैमाने पर विवरण । प्रोटोकॉल सहित पूरे दूध से नमूना तैयारी का वर्णन: नमूना lysis, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, 16S rRNA जीन के V4 क्षेत्र के प्रवर्धन, और गुणवत्ता नियंत्रण उपायों के साथ पुस्तकालय तैयारी. महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल और चर्चा मुद्दों है कि तैयारी और उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, पीसीआर अवरोधक हटाने, पर्यावरण द्वारा नमूना संदूषण, रिएजेंट, या सहित कम बायोमास नमूनों के विश्लेषण के लिए मुख्य है पर विचार प्रायोगिक सूत्रों, और प्रयोगात्मक सर्वोत्तम reproducibility सुनिश्चित करने के लिए डिजाइन प्रथाओं । जबकि प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित मानव दूध के नमूनों के लिए विशिष्ट है, यह कई कम और उच्च बायोमास नमूना प्रकार, झाड़ू पर एकत्र नमूनों, जमे हुए स्वच्छ, या एक संरक्षण बफर में स्थिर सहित के लिए अनुकूलनीय है ।
Introduction
माइक्रोबियल समुदायों कि उपनिवेश मनुष्यों को गंभीर मानव स्वास्थ्य और रोग चयापचय को प्रभावित करने के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है, प्रतिरक्षा विकास, रोग के लिए संवेदनशीलता, और टीकाकरण और ड्रग थेरेपी के लिए प्रतिक्रियाएं1, 2. मानव स्वास्थ्य पर microbiota के प्रभाव को समझने के प्रयास वर्तमान में परिभाषित शारीरिक डिब्बों के साथ जुड़े रोगाणुओं की पहचान पर जोर (यानी, त्वचा, पेट, मौखिक, आदि), साथ ही साथ स्थानीयकृत साइटों के भीतर ये कंपार्टमेंट3,4. Underpinning इन खोजी प्रयासों तेजी से उद्भव और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) प्रौद्योगिकियों कि एक नमूना के माइक्रोबियल आनुवंशिक सामग्री (microbiome) के विश्लेषण के लिए एक व्यापक समानांतर मंच प्रदान की वृद्धि की पहुंच है । कई शारीरिक नमूनों के लिए, संबद्ध microbiome दोनों जटिल और प्रचुर मात्रा में है (यानी, मल), लेकिन, कुछ नमूनों के लिए, microbiome कम माइक्रोबियल बायोमास (यानी, मानव दूध, लोअर श्वसन तंत्र) द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाता है जहां संवेदनशीलता, प्रयोगात्मक कलाकृतियों, और संभावित संदूषण प्रमुख मुद्दे बन जाते हैं । microbiome अध्ययन और उचित प्रयोगात्मक डिजाइन की आम चुनौतियों एकाधिक समीक्षा लेख5,6,7,8का विषय रहा है ।
प्रस्तुत करवायी rRNA 16S V4 क्षेत्र9 के लक्षित अनुक्रमण पर आधारित एक सुदृढ़ NGS प्रायोगिक पाइपलाइन है जो मानव दूध की microbiome को चिह्नित करने के लिए है । मानव दूध के Microbiome विश्लेषण न केवल एक स्वाभाविक कम माइक्रोबियल बायोमास10द्वारा जटिल है, लेकिन इसके अतिरिक्त मानव डीएनए पृष्ठभूमि के उच्च स्तर से11,12,13,14 और पीसीआर अवरोधकों के संभावित carryover15,16 में निकाले न्यूक्लिक एसिड । यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निष्कर्षण किटों और अर्द्ध-स्वचालित प्लेटफ़ॉर्म पर निर्भर करता है जो नमूना तैयारी बैचेस में परिवर्तनशीलता को ंयूनतम करने में मदद कर सकते हैं । यह एक अच्छी तरह से परिभाषित बैक्टीरियल नकली समुदाय है कि नमूनों के साथ एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में संसाधित है प्रोटोकॉल में हर कदम को मांय और पाइपलाइन मजबूती के एक स्वतंत्र मीट्रिक प्रदान शामिल है । हालांकि के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल मानव दूध के नमूनों के लिए विशिष्ट है, यह आसानी से मल, गुदा, योनि, त्वचा, areolar, और मौखिक झाड़ू सहित अंय नमूना प्रकार के लिए अनुकूलनीय है10,17, और के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा कर सकते है जो microbiome विश्लेषण प्रदर्शन की इच्छा शोधकर्ताओं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA के लक्षित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, microbiome लक्षण वर्णन18के लिए तेजी से तकनीक है । हालांकि, कई कारकों, सहित बैच प्रभाव, पर्यावरण संदूषण, नमूना पार-संदूषण, संवेदनशीलत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रोटोकॉल के विकास के लिए Helty Adisetiyo, पीएचडी और Shangxin यांग, पीएचडी शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । अंतर्राष्ट्रीय मातृ बाल चिकित्सा किशोर एड्स नैदानिक परीक्षण समूह (IMPAACT) के लिए कुल मिलाकर राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोगों (NIAID) के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) पुरस्कार संख्या के अंतर्गत द्वारा प्रदान किया गया था UM1AI068632 (IMPAACT एलओसी), UM1AI068616 (IMPAACT एसडीएमसी) और UM1AI106716 (IMPAACT LC), सह-वित्त पोषण के साथ Eunice कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान (niched) और राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य संस्थान (NIMH) । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NIH के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
References
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