Hedeflenen 16S sıralama insan sütü örnekleri için bir yöntem
Summary
Yarı otomatik bir iş akışı 16S rRNA insan sütü ve diğer düşük-biyokütle örnek türleri arasından hedeflenen sıralama için sunulmaktadır.
Abstract
Çalışmalar mikrobiyal toplulukların nispeten ucuz, hızlı ve yüksek işlem hacmi sıralama gelişimi ile yaygın hale gelmiştir. Ancak, tüm bu teknolojileri ile gibi tekrarlanabilir sonuçlar birleştirmek uygun önlemler ve denetimleri bir laboratuvar iş akışı üzerinde bağlıdır. Bu özellikle düşük-biyokütle örnekleri ile nerede bakteriyel DNA kirletici yanıltıcı sonuçlar üretebilir önemlidir. Bu makalede mikroplar insan meme süt örneklerinden bir düşük – için orta – throughput ölçekte 16S ribozomal RNA (rRNA) V4 bölgesinin hedeflenen sıralama kullanarak tanımlamak için yarı otomatik bir iş akışı ayrıntıları. Tam yağlı süt de dahil olmak üzere gelen numune hazırlama protokolünü açıklar: örnek lizis, nükleik asit ayıklama, amplifikasyon 16S rRNA gen ve Kütüphane hazırlık kalite kontrol önlemleri ile V4 bölgesinin. Önemlisi, protokol ve tartışma belirgin hazırlama ve analiz düşük-biyokütle örnekleri de dahil olmak üzere çevre, reaktif tarafından uygun pozitif ve negatif kontrol eder, PCR inhibitörü kaldırma, örnek kirlenme konuları göz önünde bulundurun veya deneysel kaynakları ve tekrarlanabilirlik sağlamak amacıyla tasarlanan deneysel en iyi yöntemler. Açıklandığı gibi protokol insan sütü örnekleri için belirli ise, harika veya koruma arabellekte stabilize donmuş temizleme bezi, toplanan örnekleri de dahil olmak üzere çok sayıda düşük ve yüksek biyokütle örnek türleri için uyarlanabilir.
Introduction
İnsanlar kolonize mikrobiyal toplulukların insan sağlığı ve hastalığı etkileyen metabolizma, bağışıklık geliştirme, duyarlılık hastalık ve aşı ve ilaç tedavisi1, yanıt için önemli olduğuna inanılan 2. microbiota insan sağlığı üzerindeki etkisi şu anda anlamak için çaba vurgulamak ile tanımlanmış anatomik bölmeleri (Yani, deri, bağırsak, oral, vb), yanı sıra yerelleştirilmiş sitelerle ilişkili mikroplar tanımlaması Bu bölmeler3,4. Araştırmacı bu çabalarına destek hızlı ortaya çıkması ve mikrobiyal genetik içeriği (microbiome) analiz için bir örnek kitlesel paralel bir platform sağlayan yeni nesil sıralama (NGS) teknolojilerin artan erişilebilirlik olduğunu. Pek çok fizyolojik örnekleri için karmaşık ve bol ilişkili microbiome (Yani, dışkı), ancak, bazı örnekler için microbiome tarafından düşük mikrobiyal biyokütle (Yani, insan sütü, alt solunum yolu) nerede temsil edilir duyarlılık, deneysel eserlerin ve olası bulaşma önemli konular haline. Microbiome çalışmaları ve uygun deneysel tasarım ortak sorunları birden çok gözden makaleler5,6,7,8konu oldu.
Burada sunulan sağlam bir NGS deneysel boru hattı insan sütü microbiome karakterize rRNA 16S V4 bölge9 hedeflenen sıralama üzerinde temel alır. İnsan sütü Microbiome analizi değil karmaşık sadece bir doğal olarak düşük mikrobiyal biyokütle10, ama Ayrıca tarafından yüksek düzeyde insan DNA’sı11,12,13,14 arka plan ve potansiyel ertelenmiş ayıklanan nükleik asit PCR inhibitörleri15,16 . Piyasada bulunan ayıklama kitleri ve örnek hazırlama toplu işlemleri arasında değişkenlik en aza indirmeye yardımcı yarı otomatik platformlar bu protokolü kullanır. O örnekleri protokol her adımda doğrulamak ve boru hattı sağlamlık’bağımsız bir ölçü sağlamak için kalite kontrol işlenir iyi tanımlanmış bir bakteriyel sahte topluluk birleştirmek. İletişim kuralı olarak açıklanan insan sütü örnekleri özgü olsa da, bu tabure, rektal, vajinal, Cilt, areolar ve sözlü temizleme bezi10,17de dahil olmak üzere diğer örnek türleri kolayca uyarlanabilir ve için bir başlangıç noktası olarak hizmet verebilir microbiome analizleri gerçekleştirmek isteyen araştırmacılar.
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA, hedeflenen yeni nesil sıralama microbiome karakterizasyonu18için yaygın olarak kullanılan, hızlı bir tekniktir. Ancak, toplu iş etkileri, çevresel kirlenme, örnek Çapraz bulaşma, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik dahil olmak üzere birçok faktör, olumsuz deneysel sonuçlar etkiler ve onların yorumu7,19 yıkmak , 20. en iyi sağlam 16S analizleri kolaylaştırmak için microbiome iş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Helty Adisetiyo, doktora ve Shangxin Yang, doktora Protokolü gelişimi için teşekkür etmek istiyorum. Genel destek için uluslararası anne çocuk ergen AIDS klinik denemeler grubu (IMPAACT) tarafından Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID) ulusal kurumları, Sağlık (NIH) Ödülü numaraları altında sağlanan UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) ve UM1AI106716 (IMPAACT LC), Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan geliştirme (NICHD) ve Ulusal Akıl Sağlığı Enstitüsü (NIMH) ortak fon ile. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
References
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
- Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
- Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
- Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
- Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
- Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
- Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
- Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
- Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
- Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
- Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
- Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
- Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
- Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
- Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
- Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
- Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
- Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
- Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
- Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
- Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
- . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)
