Musemodeller af Helicobacter infektion og gastrisk patologier
Summary
Mus repræsenterer en uvurderlig i vivo model til at studere infektion og sygdomme forårsaget af gastrointestinale mikroorganismer. Her, vi beskriver de metoder, der anvendes til at studere bakteriel kolonisering og histopatologiske forandringer i musemodeller af Helicobacter pylori-relateret sygdom.
Abstract
Helicobacter pylori er en gastrisk patogen, der er til stede i halvdelen af verdens befolkning og er en væsentlig årsag til morbiditet og mortalitet hos mennesker. Flere musemodeller af gastrisk Helicobacter infektion har udviklet for at studere molekylære og cellulære mekanismer hvorved H. pylori bakterier kolonisere maven i menneskelige værter og forårsage sygdom. Heri, vi beskriver protokollerne til: 1) forberede bakteriel suspensioner i vivo infektion af mus via gastrisk sonde; 2) bestemme bakteriel kolonisering niveauer i mus gastrisk væv, ved polymerase kædereaktion (PCR) og levedygtige optælling; og 3) vurdere patologiske ændringer af histologi. For at etablere Helicobactøh infektion i mus, specifikt patogenfri (SPF) dyr podes først med suspensioner (indeholdende ≥105 kolonidannende enheder, CFUs) af mus-koloniserer stammer af enten Helicobacter pylori eller andre gastrisk Helicobacter spp. fra dyr, som f.eks Helicobacter felis. På passende tidspunkter efter infektionen, er maver skåret ud og dissekeret sagittally i to lige store væv fragmenter, hver bestående af regionerne antrum og krop. En af disse fragmenter er derefter bruges til enten levedygtigt optælling eller DNA-ekstraktion, mens den anden er udsat for histologiske behandling. Bakteriel kolonisering og histopatologiske forandringer i maven kan vurderes rutinemæssigt i gastrisk væv sektioner farves med Warthin-stjernehimmel, Giemsa eller Haematoxylin og Eosin (H & E) pletter, som passende. Yderligere immunologiske analyser kan også varetages af Immunhistokemi eller immunfluorescens på musen gastrisk væv sektioner. De protokoller er beskrevet nedenfor er specielt designet til at muliggøre vurdering i mus af gastrisk patologier ligner dem i menneskelige-relaterede H. pylori sygdomme, herunder betændelse, kirtel atrofi og lymfoide follikel dannelse. Inokulum forberedelse og gastrisk sonde protokoller kan også tilpasses studere patogenesen af andre enteriske menneskelige patogener, at koloniser mus, såsom Salmonella Typhimurium eller Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori er en spiralformet, gramnegative, menneskelige gastrisk patogen til stede i alle befolkninger i hele verden med smittede i udviklingslandene skønnes for at være i størrelsesordenen 80%1. Selv om de fleste H. pylori-smittede personer er asymptomatiske, nogle udvikle mere alvorlige sygdomme, lige fra peptisk ulceration til gastrisk kræft2. H. pylori-associeret kræftformer er bredt karakteriseret ved maligne forandringer i epitelceller (GECs) eller ved dannelse af ekstra nodal lymfoide væv i maven, resulterende i gastrisk adenokarcinom eller slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) lymfom, henholdsvis. H. pylori er stærkt tilpasset til at overleve i den barske økologiske niche af maven på grund af tilstedeværelsen af forskellige virulens faktorer og mekanismer lette dens overholdelse, vækst og stofskifte i denne niche. Især besidder virulente stammer af H. pylori 40 kb cag patogenicitet ø (cagPAI) der koder ca 30 gener kræves til produktionen af en Type 4 sekretion system (T4SS)3,4 . CAG PAI-positive H. pylori stammer er forbundet med induktion af højere niveauer af kronisk betændelse i den vært, som har været impliceret som en vigtig forløber for gastrisk adenokarcinom5.
In vivo dyremodeller, især mus, har været yderst informativ ved at lade forskere at undersøge de relative bidrag af værten, bakteriel og miljømæssige faktorer på H. pylori -infektion og sygdom resultat6. Undersøgelser har tidligere vist, at langvarig H. pylori infektion af mus på C57BL/6 genetiske baggrund resulterer i udvikling af kronisk gastritis og kirtel atrofi, begge kendetegnende for H. pylori infektion7. Derudover har infektion med den relaterede katte/hunde bakteriearter, H. felis, vist sig at fremkalde MALT dannelse i mus med lignende patologi og sygdomsprogression, som set i menneskelige MALT lymfom8,9. De mest almindeligt anvendte H. pylori isolat i mus kolonisering undersøgelser er “Sydney stamme 1” (SS1) stamme10, som er cagPAI+ , men har en ikke-funktionel T4SS (T4SS−)11. Andre udbredte stammer omfatter H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 og X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. For H. felis infektioner, stamme CS1 (“kat Spiral 1” cagPAI–/T4SS−) er generelt brugt14.
Heri, giver vi en protokol, der beskriver forberedelse af Helicobacter inocula for i vivo infektion, proceduren for gastrisk sonde af mus, samt metoder til behandling af væv til undersøgelse af histopatologiske forandringer i maven. Især vil denne artikel fokusere på de histologiske metoder bruges til at visualisere bakteriel kolonisering og vurdere histopatologiske forandringer, herunder MALT dannelse, i maveslimhinden af inficerede mus. Nogle af de metoder, der beskrives her kan tilpasses til studiet af andre gut patogener som S. Typhimurium eller C. rodentium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver brugen af en i vivo musen model for Helicobacter infektion. De kritiske trin af proceduren er det: 1) forberedelse af Helicobacter inocula som indeholder levedygtige og motile bakterier; 2) levering af den passende antal bakterier til musen via gastrisk sonde; 3) påvisning af bakteriel infektion af kolonien optælling og/eller PCR; og 4) behandling af gastrisk væv til at muliggøre vurdering af histopatologisk i inficeret maver. Yderligere forslag til ændringer, fejl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Ms. A. De Paoli og Ms. Georgie Wray-McCann for teknisk bistand. Forfatterne anerkender brugen af faciliteter og tekniske bistand Monash histologi Platform, Institut for anatomi og udviklingsmæssige biologi, Monash University. Laboratoriet er støttet af midler fra National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) til RLF (APP1079930, APP1107930). RLF understøttes af en Senior Research Fellowship fra NHMRC (APP1079904). KD og MC understøttes både af Monash ph.d. stipendier. KD er også støttet af centret for medfødt immunitet og smitsom sygdomme, Hudson Institute of Medical Research, mens MC har en International Postgraduate Scholarship fra Faculty of Medicine, sygepleje og sundhedsvidenskab, Monash University. Forskning ved Hudson Institute for Medical Research er støttet af den victorianske regering operationelle infrastruktur Support Program.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
