Musmodeller av Helicobacter -infektion och Gastric patologier
Summary
Möss utgör en ovärderlig i vivo -modell för att studera infektion och sjukdomar orsakade av gastrointestinala mikroorganismer. Här beskriver vi de metoder som används för att studera bakteriell kolonisering och histopatologiska förändringar i musmodeller av Helicobacter pylori-relaterade sjukdomar.
Abstract
Helicobacter pylori är gastric patogener som förekommer i hälften av världens befolkning och är en betydande orsak till sjuklighet och dödlighet hos människor. Flera musmodeller av gastric Helicobacter -infektion har utvecklats för att studera de molekylära och cellulära mekanismer varigenom H. pylori bakterier kolonisera magen av mänskliga värdar och orsakar sjukdom. Häri, beskriver vi protokollen till: 1) förbereda bakteriell suspensioner för infektionen i vivo i möss via intragastrisk sondmatning; (2) fastställa bakteriell kolonisering nivåer i mus magsäckens vävnader, av polymeras-kedjereaktion (PCR) och livskraftig räknar; och 3) bedöma patologiska förändringar, med histologi. För att fastställa Helicobacter infektion hos möss, specifikt patogenfria (SPF) djuren inokuleras först med suspensioner (innehållande ≥105 kolonibildande enheter, CFUs) av mus-kolonisera stammar av antingen Helicobacter pylori eller andra gastric Helicobacter spp. från djur, såsom Helicobacter felis. Vid lämpliga tidpunkter efter infektionen, är magar censurerade och dissekeras sagittally i två lika vävnad fragment, vardera bestående av regionerna antrum och kroppen. En av dessa fragment används sedan för antingen lönsamt räkna eller DNA-extraktion, medan den andra utsätts för histologisk bearbetning. Bakteriell kolonisering och histopatologiska förändringar i magen får bedömas rutinmässigt i gastric vävnadssnitt färgas med Warthin-Starry, Giemsa eller hematoxylin och Eosin (H & E) fläckar, som är lämpligt. Ytterligare immunologiska analyser kan också genomföras av immunhistokemi eller immunofluorescens på mus gastric vävnadssnitt. De protokoll som beskrivs nedan är särskilt utformade för att möjliggöra bedömning hos möss av gastric patologier som liknar dem i mänskliga-relaterade H. pylori sjukdomar, inklusive inflammation, körtel atrofi och lymfoida hårsäcken bildandet. Inokulum förberedelse och intragastrisk sondmatning protokoll kan också anpassas till studerar patogenesen av andra enteriska mänskliga patogener att kolonisera möss, såsom Salmonella Typhimurium eller Citrobakter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori är spiralformade, gramnegativa, mänskliga mag patogener närvarande i alla populationer över hela världen, med infektion priser i utvecklingsländerna som uppskattas vara i storleksordningen 80%1. Även om de flesta H. pylori-infekterade individer är asymtomatiska, vissa utvecklar mer allvarliga sjukdomar, alltifrån ulcus till ventrikelcancer2. H. pylori-associerad cancer kännetecknas i huvudsak antingen genom elakartade förändringar i epitelceller (GECs) eller genom bildandet av extra nodal lymfvävnad i magen, resulterande i gastriskt adenokarcinom eller slemhinna-associerade lymfoida vävnad (MALT) lymfom, respektive. H. pylori är mycket anpassade för att överleva i den hårda ekologisk nischen i magen på grund av olika virulensfaktorer och mekanismer som underlättar dess följsamhet, tillväxt och ämnesomsättning i denna nisch. I synnerhet ha virulenta stammar av H. pylori de 40 kb cag patogenicitet Island (cagPAI) som kodar ungefär 30 gener krävs för produktionen av en typ 4 utsöndring system (T4SS)3,4 . CAG PAI-positiv H. pylori stammar är associerade med induktion av högre nivåer av kronisk inflammation i den mottagande, som har varit inblandade som en viktig föregångare av gastriskt adenokarcinom5.
In vivo djurmodeller, särskilt möss, har varit mycket informativ genom att låta forskare att undersöka de relativa bidrag av värd, bakterie- och miljömässiga faktorer på H. pylori -infektion och sjukdom resultatet6. Studier har tidigare visat att långvarig H. pylori infektion i möss på C57BL/6 genetiska bakgrunden resultaten i utvecklingen av kronisk gastrit och körteln förtvinar, båda kännetecknen för H. pylori infektion7. Infektion med de relaterade katt/hund bakteriearter, H. felis, har dessutom visat sig framkalla MALT bildas i möss med liknande patologi och sjukdomsutveckling som sett i mänskliga MALT lymfom8,9. De vanligaste H. pylori isolatet i mus colonization studier är den ”Sydney stam 1” (SS1) stam10, som är cagPAI+ men har en icke-funktionella T4SS (T4SS−)11. Andra utbredda stammar inkludera H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 och X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. För H. felis infektioner, stammen CS1 (”Cat Spiral 1”, cagPAI–/T4SS−) är allmänt använda14.
Häri, tillhandahåller vi ett protokoll som beskriver utarbetandet av Helicobacter inokulat för i vivo infektion, förfarandet för intragastrisk sondmatning av möss, samt metoder för bearbetning av vävnader för studien av histopatologiska förändringar i magen. I synnerhet kommer att denna artikel fokusera på de histologiska metoder som används för att visualisera bakteriell kolonisering och bedöma histopatologiska förändringar, inklusive bildandet av MALT, i slemhinnan i magsäcken av infekterade möss. Några av de metoder som beskrivs här kan anpassas till studiet av andra gut patogener såsom S. Typhimurium eller C. rodentium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver användning av en i vivo musmodell för Helicobacter -infektion. De kritiska steg i förfarandet är att: 1) beredning av Helicobacter inokulat som innehåller livskraftiga och rörliga bakterier; (2) leverans av antal bakterier till musen via intragastrisk sondmatning; (3) upptäckt av bakteriell infektion av kolonin räknar eller PCR. och 4) bearbetning av magsäckens vävnader för att kunna bedöma om histopatologi i infekterade magar. Ytterligare förslag på…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Ms. A. De Paoli och Ms. Georgie Wray-McCann för tekniskt bistånd. Författarna medger användning av faciliteterna och tekniskt bistånd av Monash histologi plattform, Institutionen för anatomi och utvecklingsbiologi, Monash University. Laboratoriet stöds av medel från den nationella hälso- och medicinsk forskning rådet (NHMRC) till RLF (APP1079930, APP1107930). RLF stöds av en Senior Research Fellowship från NHMRC (APP1079904). KD och MC stöds både av Monash Graduate stipendier. KD stöds också av centrum för medfödd immunitet och infektiös sjukdomar, Hudson Institute av medicinsk forskning, medan MC har en International Postgraduate stipendium från fakulteten, omvårdnad och vårdvetenskap, Monash University. Forskning vid Hudson Institute för medicinsk forskning stöds av den viktorianska regeringens operativa infrastrukturen Support Program.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
