Visualisering av kortikale moduler i flat pattedyr halvdelene
Summary
Denne artikkelen beskriver en detaljert metodikk for å få flat tangentiell deler fra pattedyr halvdelene og visualisere kortikale modulene ved hjelp av histochemical og immunohistochemical metoder.
Abstract
Cortex pattedyr hjerner er parcellated i forskjellige underlag eller moduler. Kortikale moduler vanligvis ligger parallelt kortikale arket, og kan være preget av visse histochemical og immunohistochemical metoder. I denne studien markere vi en metode for å isolere cortex fra pattedyr hjerner og flat dem for å få deler parallelt kortikale arket. Vi ytterligere høydepunkt valgt histochemical og immunohistochemical metoder for å behandle disse flatet tangentiell inndelinger for å visualisere kortikale moduler. I somatosensory cortex av ulike pattedyr utfører vi cytochrome oxidase histochemistry å avsløre kroppen kart eller kortikale moduler som representerer forskjellige deler av kroppen på dyret. I mediale entorhinal cortex, et område der rutene er generert, bruker vi immunohistochemical metoder for å markere moduler av genetisk betinget neurons som er ordnet i et rutenettmønster i kortikale arket over flere arter. Total, vi gir et rammeverk for å isolere og forberede layer-wise flat kortikale deler og visualisere kortikale moduler med histochemical og immunohistochemical metoder i en rekke pattedyr hjerner.
Introduction
Noen av de viktigste endringene i hjernen strukturen over fylogeni kan observeres i hjernebarken. Til tross for betydelige forskjeller, cortex dyr følger vanlig og kan imidlertid grovt deles i to forskjellige måter, med lag og områder1. Kortikale lag ligger parallelt med overflaten av hjernen og varierer i antall fra 3 lag i reptilian halvdelene2 til 6 lag i pattedyr halvdelene1. Kortikale områder derimot er atskilte områder på cortex som i hovedsak tilsvarer forskjellige funksjoner, f.eks, somatosensory cortex er involvert i følelsen av touch eller i hjernebarken i behandling av visuelle innganger. Disse kortikale områder kan ofte deles inn i flekker eller moduler3, som er regelmessig gjentatte anatomiske strukturer, hovedsakelig fant parallelt pial overflaten av hjernen. Kortikale moduler kan være begrenset til en bestemt lag4eller strekker seg over flere lag5.
Snitteprosessen standardmetoder for hjernen innebære deler normalt på overflaten av hjernen, som koronale eller sagittal. Mens disse metodene kan brukes til å visualisere kortikale moduler, kan en rekke interessante funksjoner vises når kortikale modulene er visualisert tangentially, i et fly parallelt på overflaten av hjernen. For eksempel somatosensory moduler i gnager hjernen representerer Visvas, vises som FAT når visualisert normalt på hjernen overflaten, og dermed regionene avlede navnet fat cortex. Imidlertid på å synliggjøre fat i en tangentiell retning, avslører de en whisker-kart, med fat opprettes i en topografiske orientering speiling den eksakte utformingen av kinnskjegg på eksternt organ overflaten. I enkelte tilfeller modulære ordningen har selv flyktet gjenkjenning for betydelig perioder, når visualisert på en ikke-tangentiell måte. Mediale entorhinal cortex, er kjent for tilstedeværelsen av rutenettet celler, neurons som brann i sekskantede mønsteret når et dyr er krysser et miljø. Selv om det er et tungt undersøkte område, inntil nylig, tilstedeværelse av oppdateringer eller moduler av celler i mediale entorhinal cortex, hadde som er fysisk lagt ut i et Sekskantet mønster6, rømt gjenkjenning. Tilstedeværelse og ordning av disse modulene, i rotte hjernen, var tilrettelagt av gjør tangentiell deler av mediale entorhinal cortex og undersøke cytoarchitecture på en layer-wise måte.
Etter snitting kan aspektet av visualisering av kortikale moduler også bli realisert på flere måter. Studier har tradisjonelt vært moduler basert på celle tetthet eller fiber oppsett1. En annen populær tilnærming er bruk av cytochrome oxidase histochemistry, som avslører områder av høyere aktivitet8. Nyere tilnærmingsmåtene er ser på genetisk betinget celletyper, utmerket på grunnlag av deres protein uttrykk profiler6,8.
I denne studien markere vi metoder for å isolere cortex fra pattedyr hjerner få utstrakte tangentiell snitt og visualisere kortikale moduler basert på cytochrome oxidase histochemistry og immunhistokjemi av celle-type spesifikke proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modularitet i hjernebarken har blitt identifisert ved hjelp av en rekke teknikker. De tidligste studier identifiseres kortikale modulene ved å enten visualisere celle tett regioner eller fravær av fiber1. Etterfølgende metoder har utnyttet tilstedeværelsen av dendrittiske bunter24, afferente fra en bestemt region25eller berikelse nevrotransmittere26. Her viser vi to teknikker, (i) cytochrome oxidase histochemistry og (ii) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Humboldt-Universität zu Berlin, Bernstein Center for beregningsorientert nevrovitenskap Berlin, tyske senter for nevrodegenerative sykdommer (DZNE), tysk Federal Utdannings og forskning (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure og Gottfried Wilhelm Leibniz prisen på DFG. Vi takker Shimpei Ishiyama for god grafisk design og Juliane Diederichs for utmerket kundestøtte.
Materials
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps – Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps – Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps – Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears – 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. . Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- . Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- . Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of “barrels” in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?. Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal’schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. . Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. . Map projections–A working manual (Vol. 1395). , (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
