Visualisering av kortikala moduler i tillplattad däggdjur Cortices
Summary
Denna artikel beskriver en detaljerad metod för att erhålla tillplattade tangentiella snitt från däggdjur cortices och visualisera kortikala moduler med histochemical och immunohistokemiska metoder.
Abstract
Cortex i däggdjurs hjärnor är parcellated in i distinkta underordnade strukturer eller moduler. Kortikala moduler vanligtvis lieparallell till kortikala blad och kan avgränsas av vissa histochemical och immunohistokemiska metoder. I denna studie belyser vi en metod för att isolera cortex från däggdjurs hjärnor och platta till dem för att få avsnitt parallell till kortikala blad. Vi ytterligare höjdpunkt utvalda histochemical och immunohistokemiska metoder att bearbeta dessa tillplattade tangentiella sektioner för att visualisera kortikala moduler. I somatosensoriska cortex av olika däggdjur utför vi cytokrom oxidas histokemi avslöja kropp kartor eller kortikal moduler som representerar olika delar av kroppen av djuret. I mediala entorhinal cortex, ett område där rutnätsceller genereras, använder vi immunohistokemiska metoder för att markera moduler av genetiskt betingade nervceller som är ordnade i ett rutnät-mönster i bladet kortikala över flera arter. Sammantaget ger vi en ram för att isolera och förbereda layer-wise tillplattad kortikala sektioner och visualisera kortikala moduler med histochemical och immunohistokemiska metoder i en mängd olika däggdjurs hjärnor.
Introduction
Några av de mest betydande förändringarna i hjärnans struktur över fylogeni kan observeras i hjärnbarken. Trots betydande skillnader, cortex av djur följer ett gemensamt mönster och kan delas på två olika sätt, genom lager och områden1. Kortikala skikt ligga parallellt med ytan av hjärnan och varierar i antal från 3 lager i reptils cortices2 till 6 lager i däggdjur cortices1. Kortikala områden är däremot distinkta områden av hjärnbarken som till stor del motsvarar distinkta funktioner, t.ex., somatosensoriska cortex är involverat i känslan av beröring eller syncentrum i bearbetning visuella ingångar. Dessa kortikala områden kan ofta delas in i fläckar eller moduler3, som regelbundet återkommande anatomiska strukturer, i huvudsak hittade parallell till pial ytan av hjärnan. Kortikala moduler kan begränsas till en viss lager4, eller sträcker sig över flera lager5.
Snittningen standardmetoder i hjärnan innebär sektioner normala till ytan av hjärnan, som koronalt eller sagittal. Medan dessa metoder kan användas för att visualisera kortikala moduler, kan en mängd intressanta funktioner avslöjas när modulerna kortikala visualiseras tangentiellt, i ett plan parallellt med ytan av hjärnan. Exempelvis somatosensoriska moduler i gnagare hjärnan som representerar morrhår, visas som fat när visualiseras normalt att hjärnan ytan, och därmed regionerna härleda namnet fat cortex. Dock på visualisera fat i en tangentiell riktning, avslöjar de en morrhår-karta, med tunnorna placeras i en topografisk orientering spegling exakta layouten på morrhåren på yttre kroppsytan. I vissa fall moduluppställning även har undgått upptäckt för betydande perioder, när visualiseras på ett icke-tangentiella sätt. Den mediala entorhinal cortexen, är känd för förekomsten av rutnätsceller, nervceller som eld i ett regelbundet hexagonala mönster när ett djur korsar en miljö. Även om det är ett tungt undersökta område, tills nyligen, förekomsten av fläckar eller moduler av celler i mediala entorhinal cortex, hade som fysiskt är lagda i ett hexagonalt mönster6, undgått upptäckt. Närvaro och arrangemang av dessa moduler, i råtthjärna, underlättades av att göra tangentiella sektioner av mediala entorhinal cortex och utreda cytoarchitecture på ett sätt som konstruktionsdata.
Efter snittning, kan den särskilda aspekten av visualisering av kortikala moduler också realiseras på flera sätt. Studier har klassiskt, avgränsad moduler baserade på cell densiteten eller fiber layout1. En annan populär metod är användningen av cytokrom oxidas histokemi, som avslöjar områden av högre aktivitet8. Nyare metoder inkluderar tittar på genetiskt bestämd celltyper, distingerad på grundval av deras protein uttryck profiler6,8.
I denna studie belyser vi metoder för att isolera cortex från däggdjurs hjärnor, få tillplattade tangentiella snitt och visualisera kortikala moduler baserade på cytokrom oxidas histokemi och immunohistokemi av celltyp specifika proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modularitet i hjärnbarken har identifierats med hjälp av olika tekniker. De tidigaste studier vanligtvis identifieras kortikala modulerna genom att antingen visualisera cell tät regioner, eller avsaknad av fibrer1. Efterföljande metoder har utnyttjat förekomsten av dendritiska buntarna24, afferenter från en viss region25eller anrikning av signalsubstanser26. Här visar vi två tekniker, a cytokrom oxidas histokemi och (i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Humboldt-Universität zu Berlin, Bernstein Center for Computational neurovetenskap Berlin, den tyska Center för neurodegenerativa sjukdomar (DZNE), den tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure och Gottfried Wilhelm Leibniz pris av DFGEN. Vi tackar Shimpei Ishiyama för utmärkt grafisk design och Juliane Diederichs för utmärkt teknisk assistans.
Materials
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps – Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps – Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps – Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears – 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. . Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- . Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- . Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of “barrels” in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?. Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal’schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. . Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. . Map projections–A working manual (Vol. 1395). , (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
