Målet med denne protokollen er å oppnå høy levedyktighet og høy avkastning av hepatocytter og sinusformet endotelceller fra leveren. Dette oppnås ved perfusing leveren med en type IV collagenase løsning via portalen blodåre, etterfulgt av differensial sentrifugering hepatocytter og sinusformet endotelceller.
Denne protokollen viser en metode for høy avkastning og levedyktigheten for musen hepatocytter og sinusformet endotelceller (sek) egnet for dyrking eller skaffe celle lysates. I denne protokollen brukes portalen blodåre som stedet for catheterization, snarere enn vena cava, som dette begrenser forurensning av andre mulige celletyper i leveren servering. Det kreves ingen spesiell instrumentering i hele denne prosedyren. Et vannbad brukes som en kilde til varme til å opprettholde temperaturen i alle buffere og løsninger. En standard peristaltiske pumpe brukes til å kjøre væske, og en nedkjølt bord sentrifuge kreves for sentrifugering prosedyrene. Den eneste begrensningen for denne teknikken er plasseringen av kateter i portalen blodåre, som er utfordrende på noen av musene i 18-25 g størrelse rekkevidde. En fordel med denne teknikken er at bare en åre benyttes for perfusjonen og tilgang til venen er raskt, som minimerer iskemi og reperfusion av leveren som reduserer hepatic celle levedyktighet. En annen fordel med denne protokollen er at det er enkelt å skille live fra døde hepatocytter av syn på grunn av forskjellen i mobilnettet tetthet under sentrifugering trinnene. Celler fra denne protokollen kan være brukt i cellekultur for nedstrøms programmer som behandlet for noen biokjemiske vurdering.
Collagenase perfusjon av leveren for å få hepatocytter er utført siden tidlig på 1950-tallet og har blitt stadig forbedres1,2,3,4. En veldig fin gjennomgang av mange av de metoder, teknikker og reagenser i liver celle rensing er utarbeidet i Meyer et al5. Få en tilfredsstillende avkastning av svært levedyktig hepatocytter og sek er teknisk utfordrende. De mekaniske kreftene som skiller cellene inkludert kvaliteten på collagenase er noen av variablene som er vanskelig å kontrollere. På grunn av hepatocyte følsomhet for mekaniske krefter reduseres deres levedyktighet markert i sub-optimale forhold, spørre behovet for en protokoll som beskriver optimale forhold for isolasjon. Sekunder synes ikke å være så følsomme for mekanisk klipping. In situ perfusjon collagenase fordøyelsen er langt den beste metoden å forstyrre celle-celle veikryss for å få enkeltcelle preparater fra lever og andre organer som tarm og milt6. Denne protokollen demonstrerer en enkel metode for å innføre perfusjon buffer i portalen blodåre ved hjelp av en uttrekkbar plast kateter i stedet for et snitt som kan forårsake portalen blodåre å kollapse, som beskrevet i Smedsrød et al7.
Målet med dette manuskriptet er å vise de viktigste trinnene som kreves for suksess i leveren overflod prosedyren. Disse trinnene omfatter kateter plassering, flyt av perfusjon væsker og håndtering av vev etter fordøyelsen. Strømningshastigheten er justert utover den naturlige blodstrøm, men lav nok til å holde den Glisson kapsel intakt. Når leveren er riktig fordøyd og cellene blir separert i løsningen, er celle rensing relativt enkel om det utføres av differensial sentrifugering, plate heft eller magnetiske perle rensing. Live hepatocytter har en høyere tetthet og er lett renset fra nonparenchymal stamceller (NPC) og døde hepatocytter med lav hastighet sentrifugering. De fleste programmer plate vedheft til å skille Kupffer celler (KCs) og sekunder er en felles metode8, men det finnes rapporter om at det ikke produserer beste renheten av sek9. Markedsledende har en tendens til å følge solide stive flater raskt og Petri retter (standard polystyren) er den mest brukte materialet for denne prosedyren. SEC eller KC rensing med bruk av antistoff-konjugerte magnetiske perler er utvilsomt den beste metoden for betydelig rensing av disse cellene, men fremgangsmåten legger en annen 3-4 h på denne protokollen og totale avkastningen er redusert9. Denne rapporten viser i detalj prosessen for en optimal leveren perfusjon som vanligvis gir mange levedyktige cellers.
Denne protokollen fremhever verktøyene som er tilgjengelige og som vil gi brukeren en høy grad av suksess i denne fremgangsmåten. En vellykket perfusjon er grunnleggende for alle nedstrøms programmer når du arbeider med primær celler.
Det er noen kritiske trinnene av fremgangsmåten som bestemmer suksess. Først må plassering kateter tips i portalen blodåre være riktig. Hvis plassert langt inne i leveren, vil bare små lobes være parfyme. Spissen bør være like nedenfor høyre og venstre grenene i portalen blodåre. Fordelen med å bruke en polymer-kompositt kateter over en nål er at barb nålen er mer sannsynlig å rive venen under perfusjon enn et kateter. Andre bestemmer collagenase kvaliteten og kvantiteten fordøyelsen effektiviteten i leveren. I denne fremgangsmåten prekvalifisert collagenase Type 4 ble brukt og det er resuspended på 0,5 mg/mL i Buffer 2 Hvis collagenase aktiviteten å være assayed er større enn 900 IU.
På slutten av collagenase perfusjon, bør leveren beholde en litt mørk brunfarge til brun farge. Hvis det er en lys brun farge, så er de fleste av hepatocytter død. Leveren bør falle fra hverandre da kuttet fra musen. I de beste forholdene, kan leveren øses ut av kroppens hulrom av musen med en liten skje. Lever i denne tilstanden gi alltid svært høyt levedyktighet. Hvis det tar mye arbeid å riste cellene fra hverandre, hvis leveren er fortsatt fast ved utpakking, eller hvis det er mye av makt må flytte hepatocytter gjennom filtrene, må hepatocytter en lavere levedyktighet. Hepatocytter er dekket med microvilli, som tillater dem å ha en meget høy overflate (Figur 10). Ufullstendig fordøyelsen beholder celle-celle veikryss mellom hepatocytter, og mekanisk klipping vil flerre plasma membranen. In situ perfusjon med collagenase er den beste metoden å bryte cellene og opprettholde høy levedyktighet. I Figur 11, ble to hepatocyte forberedelser er laget i som cellen pellets sammenlignet etter noen gangers vask i Buffer 1. Pellets til venstre er lettere og inneholder en celle levedyktigheten til 50%. Pellets til høyre er mørkere og har en levedyktigheten til 92%. Tilsvarende når væske helles fra de 50 mL koniske, er det mørkere pellet i røret, i kontrast til de lysere pellet, som vil gli i røret som væske helles av. Lavere celle levedyktighet eller ineffektiv perfusions kan oppstå når leveren har høye nivåer av sklerose.
Siden live hepatocytter har en høyere tetthet enn døde hepatocytter, vil sentrifugering prosedyrer resultere i et preparat som er svært ren i levedyktig hepatocytter15. Hvis det er en betydelig mengde døde hepatocytter (som ofte oppstår når forholdene er suboptimal), live kan celler være ytterligere beriket og atskilt fra døde celler med PVP graderinger. I tillegg siden live hepatocytter pellets raskere enn døde hepatocytter, vil aspirasjon av topp 3rd av pellet også øke andelen levende døde celler i pellet. Disse prosedyrene er raske og enkle metoder for å skille live fra døde hepatocytter og celle rusk når behøvde10,16. Dette er spesielt nyttig hvis prøven er dyrebare, og bare et par millioner celler kreves for eksperimentet.
I konklusjonen, er dette en enkel og effektiv metode for høsting hepatocytter og sekunder fra leveren. På dagens priser er kostnaden ved å utføre denne prosedyren inkludert alle reagenser og forbruksmateriell under 75 USD per forberedelse. Hvis flere mus er ønskelig, er det best å fortsette med hepatocyte rensing og holde NPC brøken på is til alle mus er behandlet. NPC er generelt stabile på is minst 5 h, men lengre tid har ikke blitt testet i dette laboratoriet.
The authors have nothing to disclose.
Midlene er gitt i del av NIH fra grant R01HL130864.
1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
sterlized spoon | Home supply store | ||
Cotton ball(s) | Home supply store | ||
Polyester sewing thread | Home supply store | ||
Masking tape | Home supply store | ||
thumb tacks | Home supply store | ||
styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
cookie/baking sheet | Home supply store | ||
Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
Crystallizing dishes 100×50 | VWR | 89000-290 | |
Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
Reagents | |||
Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
KCl | 0.5 | 6.7 | |
HEPES | 2.4 | 10 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
KCl | 0.5 | 6.71 | |
CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
HEPES | 24 | 100 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
KCl | 0.35 | 4.7 | |
MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
HEPES | 2.4 | 10 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
KCl | 0.2 | 2.7 | |
Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
Other reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
Hepatocyte Growth Medium | |||
DMEM | Gibco | 11965118 | |
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
DMEM | |||
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
LSEC medium | |||
RPMI | Gibco | 11875119 | |
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |