Målet med detta protokoll är att få hög lönsamhet och hög avkastning av hepatocyter och sinusformad endotelceller från levern. Detta sker genom startas levern med en typ IV kollagenas lösning via portalen ven, följt av differentiell centrifugering att få hepatocyter och sinusformad endotelceller.
Detta protokoll visar en metod för att få hög avkastning och lönsamhet för mus hepatocyter och sinusformad endotelceller (SEK) lämplig för odling eller för att erhålla cell lysates. I detta protokoll används portalen ven som platsen för kateterisering, i stället för vena cava, eftersom detta begränsar förorening av andra möjliga celltyper i slutliga lever preparatet. Det krävs ingen särskild instrumentation under hela förfarandet. Ett vattenbad används som värmekälla för att bibehålla temperaturen av alla buffertar och lösningar. En standard peristaltiska pumpen används för att driva vätskan och en kyld bordsskiva centrifug krävs för centrifugering förfaranden. Den enda begränsningen av denna teknik är placeringen av katetern inom portalen ven, vilket en utmaning på några av möss i intervallet 18-25 g storlek. En fördel med denna teknik är att endast en ven utnyttjas för perfusionen och tillgång till venen är snabbt, vilket minimerar ischemi och reperfusion av levern som minskar hepatisk cellernas viabilitet. En annan fördel med detta protokoll är att det är lätt att skilja live från döda hepatocyter av syn på grund av skillnaden i cellulära densitet under centrifugering stegen. Celler från detta protokoll kan vara används i cellodling för alla efterföljande program samt behandlas någon biokemiska bedömning.
Kollagenas perfusion av levern för att erhålla hepatocyter har utförts sedan 1950 och har förbättrats kontinuerligt1,2,3,4. En mycket fin recension av många av de metoder, tekniker och reagenser som används i leverceller rening har sammanställts i Meyer et al5. Att få en tillfredsställande avkastning mycket livskraftig hepatocyter och SECs är tekniskt utmanande. De mekaniska krafter som separata celler inklusive kvaliteten på kollagenas är några av de variabler som är svåra att kontrollera. På grund av hepatocyte känslighet för mekaniska krafter reduceras deras livskraft markant under optimala förhållanden, föranledde behovet av ett protokoll som beskriver optimala förhållanden för isolering. SECs verkar inte vara lika känslig för mekanisk klippning. In situ perfusion med kollagenas matsmältningen är överlägset den bästa metoden att störa cell cell korsningar för att få enskild cell preparat från levern och andra organ till exempel tarmen och mjälte6. Detta protokoll visar en enkel metod för att införa perfusion buffert i portalen ven genom att använda en infällbar plast kateter i stället för ett snitt som kan orsaka portalen ven till kollaps, som beskrivs i Smedsrød et al7.
Målet med detta manuskript är att visa de mest kritiska steg som krävs för framgång i förfarandet för levern överflöd. Dessa steg omfattar katetern placering, flödet av perfusion vätskor, och hantering av vävnad efter matsmältningen. Flöden är justerad ovanför andelen naturliga blodflödet, men tillräckligt låg för att hålla den Glissons kapsel intakt. När levern är ordentligt rötas och celler separeras i lösning, är cell rening relativt enkelt om det utförs av differentiell centrifugering, plattan vidhäftning, eller magnetiska pärla rening. Levande hepatocyter har en högre densitet och renas enkelt från nonparenchymal celler (NPC) och döda hepatocyter med långsam centrifugering. För de flesta tillämpningar, plattan vidhäftning för att separera Kupffers celler (KCs) och SEK är en gemensam metod8, men det finns rapporter om att det inte producera SECs9bästa renhet. KCs har en tendens att hålla sig till fasta styva ytor snabbt och petriskålar (standard polystyren) är det vanligaste materialet för detta förfarande. SEC eller KC rening med hjälp av antikropp-konjugerad magnetiska pärlor är tveklöst den bästa metoden för betydande rening av dessa celler, men proceduren lägger till en annan 3-4 h på detta protokoll och den totala avkastningen är minskad9. Detta betänkande visar i detalj processen för en optimal leverns genomblödning som vanligtvis ger en hög antalet livskraftiga celler.
Detta protokoll belyser de verktyg som finns och som kommer att ge användaren en hög grad av framgång i detta förfarande. En framgångsrik perfusion är grundläggande för alla efterföljande program när du arbetar med primära celler.
Det finns några kritiska steg i förfarandet som avgör framgång. Först, placering av kateterspetsen inom portalen ven måste vara korrekt. Om placerade för långt inuti levern, kommer endast mindre loberna vara perfusion. Spetsen bör vara strax under höger och vänster grenarna i portalen ven. Fördelen med att använda en polymer-komposit kateter över en nål är att barb nålspetsen är mer sannolikt att riva venen under perfusionen än en kateter. För det andra, kollagenas kvalitet och kvantitet bestämmer matsmältningen effektiviteten i levern. I den här proceduren pre-kvalificerad kollagenas typ 4 användes och det är resuspended 0,5 mg/ml i buffert 2 om aktiviteten kollagenas att analyseras är större än 900 IE.
I slutet av kollagenas perfusionen, bör levern behålla en något mörk solbränna till brun färg. Om det är en ljus brun färg, då är de flesta av hepatocyterna döda. Levern bör vara faller isär när man skär från musen. Under de bästa förhållandena, kan levern vara öste ur kroppen hålighet i musen med en liten sked. Lever i detta tillstånd ger alltid mycket hög cellernas viabilitet. Om det tar mycket ansträngning att skaka cellerna isär, om levern är fortfarande fast under extraktion, eller om det finns en hel del kraft som krävs för att flytta hepatocyterna genom filtren, kommer att sedan hepatocyterna ha en lägre lönsamhet. Hepatocyter är täckta med Mikrovilli, som tillåter dem att ha en mycket hög yta (figur 10). Ofullständig matsmältning behåller cell cell korsningar mellan hepatocyter och mekanisk klippning kommer slita plasmamembranet isär. In situ perfusion med kollagenas är den bästa metoden att sönder cellerna och upprätthålla hög lönsamhet. I figur 11jämfördes två hepatocyte preparat görs i som cellen pellets efter några tvättar i buffert 1. Pelleten till vänster är lättare och innehåller en cellviabilitet på ca 50%. Pelleten till höger är mörkare och har en bärkraft på 92%. Likaså när vätskan hälls från 50 mL koniska, är mörkare pelleten stationära inom röret, i motsats till den lätta pelleten, som kommer att glida i röret som vätskan hälls bort. Lägre cellviabilitet eller ineffektiva perfusioner kan uppstå när levern har höga nivåer av skleros.
Eftersom levande hepatocyter har en högre densitet än döda hepatocyter, kommer att centrifugering förfarandena resultera i ett preparat som är mycket ren i livskraftiga hepatocyter15. Om det finns en betydande mängd döda hepatocyter (vilket ofta sker när förhållandena är suboptimal), levande kan celler vara ytterligare berikad och separerade från döda celler använder PVP övertoningar. Dessutom, eftersom levande hepatocyter pellet snabbare än döda hepatocyter, ökar aspiration av top 3rd av pelleten också förhållandet av levande döda celler i pelleten. Dessa förfaranden är snabba och enkla metoder för att separera live från döda hepatocyter och cell skräp när det behövs10,16. Detta är särskilt användbart om provet är dyrbar, och endast några miljoner celler krävs för experimentet.
Sammanfattningsvis är detta en enkel och effektiv metod för skörd hepatocyter och SECs från levern. I löpande priser är kostnaden för att utföra proceduren inklusive alla reagenser och engångsartiklar under 75 USD per förberedelse. Om flera möss önskas, är det bäst att gå vidare med hepatocyte rening och hålla det NPC bråket på is tills alla möss har bearbetats. NPC är generellt stabil på is för minst 5 h, men längre tider inte har testats i detta laboratorium.
The authors have nothing to disclose.
Finansieras delvis av NIH från grant R01HL130864.
1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
sterlized spoon | Home supply store | ||
Cotton ball(s) | Home supply store | ||
Polyester sewing thread | Home supply store | ||
Masking tape | Home supply store | ||
thumb tacks | Home supply store | ||
styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
cookie/baking sheet | Home supply store | ||
Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
Crystallizing dishes 100×50 | VWR | 89000-290 | |
Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
Reagents | |||
Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
KCl | 0.5 | 6.7 | |
HEPES | 2.4 | 10 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
KCl | 0.5 | 6.71 | |
CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
HEPES | 24 | 100 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
KCl | 0.35 | 4.7 | |
MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
HEPES | 2.4 | 10 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
KCl | 0.2 | 2.7 | |
Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
Other reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
Hepatocyte Growth Medium | |||
DMEM | Gibco | 11965118 | |
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
DMEM | |||
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
LSEC medium | |||
RPMI | Gibco | 11875119 | |
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |