Dette arbejde beskrives en protokol for generation af høj opløsning i situ Hi-C biblioteker fra stramt iscenesat præ gastrulation Drosophila melanogaster embryoner.
Undersøge den tre-dimensionelle arkitektur af kromatin tilbyder uvurderlig indsigt i mekanismerne af genregulering. Her, vi beskriver en protokol for at udføre kromatin kropsbygning capture teknik i situ Hi-C på iscenesat Drosophila melanogaster embryo populationer. Resultatet er en sekventering bibliotek, der giver mulighed for kortlægning af alle kromatin samspil, der opstår i kernen i et enkelt eksperiment. Embryo sortering gøres manuelt ved hjælp af en fluorescerende stereo-mikroskop og en transgene fluelinen indeholdende en nuklear markør. Ved hjælp af denne teknik, embryo befolkninger fra hver nukleare division cyklus og med definerede cellecyklus status, kan opnås med meget høj renhed. Protokollen kan også tilpasses sorterer ældre embryoner ud over gastrulation. Sorterede embryoner bruges som input for i situ Hi-C. Alle forsøgene, herunder sekventering bibliotek forberedelse, kan være afsluttet i fem dage. Protokollen har lav input krav og virker pålideligt bruge 20 blastoderm fase embryoner som input materiale. Slutresultatet er en sekventering bibliotek for næste generation sequencing. Efter sekvensering, kan dataene, der forarbejdes til genome-wide kromatin interaktion kort, der kan analyseres ved hjælp af en bred vifte af tilgængelige værktøjer til at få information om topologisk tilknytning domænestruktur (TAD), kromatin sløjfer og kromatin rum under Drosophila udvikling.
Kromatin kropsbygning capture (3C) fremstod som en særdeles nyttig metode til at studere topologi af kromatin i nucleus1. 3C variant Hi-C giver mulighed for måling af kontakt frekvenser af alle kromatin samspil, der opstår i kernen i en enkelt eksperiment2. Anvendelse af Hi-C har spillet en vigtig rolle i opdagelsen og karakterisering af mange grundlæggende principper af kromatin organisation, som TADs, rum og sløjfer3,4,5.
Undersøgelser af kromatin arkitektur i forbindelse med udviklingsmæssige overgange og Celledifferentiering bruges i stigende grad at udrede mekanismerne af genregulering under disse processer6,7,8, 9. En af modelorganismer af stor interesse er Drosophila melanogaster, hvis udvikling og genom er godt præget. Men få studier, der undersøger kromatin arkitektur i Drosophila uden for in vitro- vævskultur indstillinger har været foretaget10,11. I embryoner blev 16 – 18 h post befrugtning, TADs og rum der minder om lignende strukturer i pattedyr identificeret10, hvilket rejser spørgsmålet om, hvilken rolle de spiller i RIBOREGULATION i Drosophila embryo udvikling. Især i de tidlige stadier af udvikling, før gastrulation, er sådanne undersøgelser teknisk udfordrende. Før gastrulation gennemgå Drosophila embryoner 13 synkron nukleare divisioner, der fortsætter i en ekstremt hurtigt tempo på 8-60 min. per cyklus12,13. Ud over dette, manglen visuelle funktioner til at skelne de forskellige faser gør det vanskeligt at opnå stramt iscenesatte embryo materiale i tilstrækkelige mængder.
For at udvikle en protokol, der giver mulighed for at studere kromatin arkitektur i tidlige Drosophila udvikling henne ved nuklear cyklus dagsorden, vi kombineret to eksisterende teknikker: i situ Hi-C, der giver mulighed for generation af høj opløsning hele genom kontakt kort5, og embryo iscenesættelse ved hjælp af en transgene Drosophila linje at udtrykke en eGFP-PCNA transgen13,14. Denne transgen lokaliserer til kernen under interphase og spreder i hele den syncytial blastoderm under mitosen. Ved hjælp af denne egenskab, kan man let skelne forskellige stadier af deres nukleare tæthed og mitotiske embryoner ved spredning af normal god landbrugspraksis signal.
Sammen, disse teknikker aktiverer studerer den tre-dimensionelle struktur af kromatin i høj opløsning fra så lidt som 20 Drosophila embryoner. Denne protokol indeholder instruktioner til høst og sortering Drosophila embryoner at opnå populationer af embryoner fra en enkelt nukleare division cyklus. Det beskrives yderligere, hvordan de opnåede embryoner bruges til at udføre i situ Hi-C. Slutresultatet er et nukleotid bibliotek egnet til sekvensering på næste generation sequencing maskiner. De resulterende sekventering læser kan derefter forarbejdes til detaljerede kromatin interaktion kort dækker hele Drosophila genomet.
Protokollen præsenteres her er meget effektiv til at skabe høj kvalitet kort af kromatin arkitektur i tidlige Drosophila embryoner. Sammenlignet med en tidligere protokollen34, bruger fremgangsmåden her en up-to-date i situ Hi-C procedure5, resulterer i hurtigere behandling, højere opløsning, og mindre brug af reagens. Den generelle procedure herunder i situ Hi-C protokollen forventes at arbejde på en lang række faser og eksperimentelle systemer udover Drosophila. Da protokollen har en lav input krav, kan den også bruges på isolerede cellepopulationer. I Drosophila, når ved hjælp af protokollen for embryoner uden for intervallet beskrevet her, nogle parametre, navnlig fiksering af materialet, skal måske justeres. Da ældre embryoner udvikler et stærkt vandtætte kutikula, kan at hæve koncentrationen af formaldehyd og forlænge fiksering være passende. Til samling af embryoner i faser end nuklear cyklus 14, inkuberingstider af embryoner ved 25 ° C i trin 1.4 skal justeres som følger: nukleare cyklus 12, 70 min.; nukleare cyklus 13, 90 min; 3 – 4 hpf, 3:30 h.
I løbet af 13 kavalergang divisionerne (fase 1-4), fordobler kerner massefylde ca med hver division. Kerner kan let identificeres ved deres lyse normal god landbrugspraksis fluorescens. Under mitosen, eGFP-PCNA er ikke placeret i kernen, og signalet er spredt over hele fosteret. Denne funktion gør at identificere embryoner, der befinder sig i en synkron kavalergang division muligt. For at studere kromatin kropsbygning, er disse mitotiske embryoner normalt ikke ønskeligt, da den mitotiske organisationen af kromatin er drastisk anderledes end interphase organisation35. Det er muligt at tilpasse protokollen du specifikt vælger embryoner undergår en synkron mitotiske division. I dette tilfælde kun embryoner med spredte, ikke-nukleare distribution af eGFP-PCNA skal holdes, og alle andre embryoner skal kasseres. Da den nukleare tæthed ikke kan bestemmes, skal alternative metoder til fase embryoner ved deres morfologi, set i overførte lysmikroskopi være ansat. Tilstedeværelsen af stangen celler og cellekerner i embryo periferien indikere, at fosteret har afsluttet mindst nukleare cyklus 9, synlige cellularization i periferien viser nukleare cyklus 1412.
Hej-C eksperimenter kan udføres korrekt, ved hjælp af et bredt udvalg af restriktionsenzymer5. Nuværende metoder bruger typisk enzymer, der genkender enten en 4-base sekvens, såsom MboI, eller en 6-base genkendelsessekvens, såsom HindIII. Fordelen ved 4-base kuttere over 6-base kuttere er, at de tilbyder højere potentielle opløsning, givet nok sekventering dybde, og en mere jævn dækning af begrænsning websteder på tværs af genomet. Der er ingen klar fordel i at vælge en 4-base fræser over en anden5,23,36,37. De to mest almindeligt anvendte enzymer, MboI og DpnII, genkende begge den samme GATC’EN anerkendelse websted. DpnII er mindre følsomme over for CpG methylering, der er ikke noget problem i Drosophila. Protokollen præsenteres her kan også være fuldført ved hjælp af DpnII som en begrænsning enzym. I afsnit 4.2. begrænsning enzym og buffer har tilpasses DpnII kompatibilitet, efter producentens anvisninger.
Hvis biblioteket sekventering fragment størrelse afviger betydeligt fra det område, vist i figur 2A, kan klynge dannelse under sekventering være mindre effektive eller mislykkes helt. I dette tilfælde den størrelse fordeling efter klipning bør kontrolleres og klipning parametre justeret i overensstemmelse hermed. Toppe i fordelingen af DNA fragmenter af meget små ( 1.000 bp) størrelser angiver problemer med størrelse udvælgelse, som bære perler eller supernatanten, som formodes at blive kasseret. Ofte disse biblioteker med små toppe på disse uønskede størrelser, såsom en afbilledet, er stadig sekventeret held med kun et mindre fald i klynger effektivitet.
Høje priser af PCR dobbeltarbejde bør undgås, fordi det drastisk reducerer antallet af anvendelige sekvens læser. Sats af PCR dubletter er direkte relateret til mængden af tilført materiale. Ved hjælp af flere input derfor afbøder normalt problemer med PCR dobbeltarbejde.
Højere antal læsninger filtreret på grund af Læs orientering ()figur 2B) angiver utilstrækkelig fordøjelse, som kan være resultatet af bruger for lidt enzym, for meget input materiale eller ufuldstændig homogenisering af embryoner.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af Max Planck Society. C.B.H. blev støttet af et stipendium fra internationale Max Planck Research School – molekylær biomedicin. Vi takker Shelby Blythe og Eric Wieschaus venligst give eGFP-PCNA Drosophila melanogaster linje.
Biotin-14-dATP | Life Technologies | 19524016 | |
MboI | New England Biolabs | R0147L | |
DNA Polymerase I Klenow Fragment | New England Biolabs | M0210L | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher | EL0012 | T4 DNA Ligase Buffer included |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
Proteinase K | AppliChem | A4392 | |
GlycoBlue | Life Technologies | AM9516 | |
Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors | Roche | 5892791001 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335 | Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England Biolabs | E7645 | End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit |
Covaris S2 AFA System | Covaris | ||
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030108051 | |
Falcon cell strainer 100 µm | Corning | 352360 | Embryo collection baskets |
37% formaldehyde | VWR | 437536C | |
Heptane | AppliChem | 122062.1612 | |
M165 FC fluorescent stereo microscope | Leica | ||
M165 FC DFC camera | Leica | ||
Metal micro pestle | Carl Roth | P985.1 | Used to lyse embryos in step 4.1.4 |
RNase A | AppliChem | A3832,0050 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65002 | Streptavidin coated magnetic beads |
Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
eGFP-PCNA flies | Gift from S. Blythe and E. Wieschaus | ||
Sodium hypochlorite 13% | Thermo Fisher | AC219255000 | |
Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology | AppliChem | A4577 | |
NaCl | AppliChem | A2942 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
SDS for molecular biology | AppliChem | A2263 | |
10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
PCR Nucleotide Mix | Sigma-Aldrich | 11814362001 | Unmodified dCTP, dGTP, dTTP |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
EDTA 0.5M solution for molecular biology | AppliChem | A4892 | |
Sodium acetate 3M pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | Magnetic stand |
Intelli-Mixer RM-2L | Omnilab | 5729802 | Rotator |
ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | Mixer |
Small Embryo Collection Cages | Flystuff.com | 59-100 | Egg collection cage |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000413 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
PCR tube strips | Greiner Bio-One | 673275 | |
NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | T4 DNA Polymerase buffer |