Detta arbete beskriver ett protokoll för generering av hög upplösning i situ Hi-C bibliotek från iscensatt tätt före gastrulation Drosophila melanogaster embryon.
Utreda den tredimensionella arkitekturen av kromatin erbjuder ovärderlig inblick i mekanismerna för genreglering. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra den kromatin konformation capture teknik i situ Hi-C på iscensatt Drosophila melanogaster embryo populationer. Resultatet är en sekvensering bibliotek som låter kartläggning av alla kromatin-interaktioner som inträffar i kärnan i ett enda experiment. Embryo sortering görs manuellt med en fluorescerande stereo Mikroskop och en transgena linan som innehåller en nukleär markör. Med hjälp av denna teknik, embryo populationer från varje nukleära division cykel, och med definierade cellcykeln status, kan erhållas med mycket hög renhet. Protokollet kan också anpassas till sortera äldre embryon bortom gastrulation. Sorterade embryon används som insatsvaror för i situ Hi-C. Alla experiment, inklusive sekvensering bibliotek förberedelse, kan slutföras i fem dagar. Protokollet har låga ingående krav och fungerar tillförlitligt med 20 blastoderm scenen embryon som insatsmaterial. Slutresultatet är en sekvensering bibliotek för nästa generations sekvensering. Efter sekvensering, kan data bearbetas till genome-wide kromatin interaktion kartor som kan analyseras med hjälp av ett brett utbud av tillgängliga verktyg för att få information om topologically associera domänstruktur (TAD), kromatin loopar och kromatin fack under Drosophila utveckling.
Kromatin konformation capture (3C) har vuxit fram som en exceptionellt bra metod att studera topologin av kromatin i nucleus1. 3C varianten Hi-C tillåter mätning kontakt frekvenserna av alla kromatin-interaktioner som inträffar i kärnan i en enda experiment2. Tillämpningen av Hi-C har spelat en viktig roll i upptäckten och karakterisering av många grundläggande principer av kromatin organisation, till exempel TADs, fack och loopar3,4,5.
Studier av kromatin arkitektur inom ramen för utvecklingstoxicitet övergångar och celldifferentiering används alltmer att nysta upp mekanismer för genreglering vid dessa processer6,7,8, 9. En av modellorganismerna av stort intresse är Drosophila melanogaster, vars utveckling och arvsmassan är väl karakteriserade. Dock genomföras få studier som undersöker kromatin arkitektur i Drosophila utanför i vitro vävnadsodling inställningar har varit10,11. I embryon var 16 – 18 h post befruktning, TADs och fack som påminner om liknande strukturer i däggdjur identifierade10, vilket väcker frågan om vilken roll de spelar i genreglering vid Drosophila embryo utveckling. Särskilt i de tidiga stadierna av utveckling, före gastrulation, är sådana studier tekniskt utmanande. Innan gastrulation genomgå Drosophila embryon 13 synkron nukleära uppdelningar som går i en extremt snabb takt 8 – 60 min per cykel12,13. Utöver detta, bristen på visuella funktioner att skilja de olika stadierna gör det svårt att få tätt stegvis embryo material i tillräckliga mängder.
För att utveckla ett protokoll som tillåter studera kromatin arkitekturen i tidiga Drosophila utveckling på nukleära cykel upplösning, vi kombinerat två befintliga tekniker: i situ Hi-C, vilken tillåt generering av hög upplösning hela genomet kontakt kartor5och embryo iscensättning med hjälp av en transgen Drosophila uttrycker en andra-PCNA transgenens13,14. Detta transgenens lokaliserar till kärnan under interfasen och skingrar i hela den syncytial blastoderm under Mitos. Med den här egenskapen, är det möjligt att enkelt skilja olika stadier av deras nukleära densitet och mitotiska embryon av spridningen av GFP signalen.
Tillsammans, dessa tekniker möjliggör studera den tredimensionella strukturen av kromatin i hög upplösning från så få som 20 Drosophila embryon. Detta protokoll innehåller instruktionerna för skörd och sortering Drosophila embryon att få populationer av embryon från en division och kärn-cykel. Den beskriver vidare hur de erhållna embryona används för att utföra i situ Hi-C. Slutresultatet är en nukleotid bibliotek passar sekvensering på nästa generations sekvensering-maskiner. Den resulterande sekvensering läser kan sedan förädlas till detaljerad kromatin interaktion kartor som täcker hela Drosophila genomet.
Det protokoll som presenteras här är mycket effektiv på att skapa högkvalitativa kartor av kromatin arkitektur i tidiga Drosophila embryon. Jämfört med ett tidigare protokoll34, använder den metod som beskrivs här en aktuell i situ Hi-C förfarande5, vilket resulterar i snabbare bearbetning, högre upplösning, och mindre reagens användning. Det övergripande förfarandet inklusive i situ Hi-C protokollet förväntas arbeta på en rad olika stadier och experimentella system förutom Drosophila. Eftersom protokollet har en låg ingång krav, kan det också användas på isolerade cellpopulationer. I Drosophila, när använda protokollet för embryon utanför intervallet som beskrivs här, vissa parametrar, kan särskilt fixering av materialet, behöva justeras. Eftersom äldre embryon utveckla en mycket tät nagelband, kan höja koncentrationen av formaldehyd och förlänga fixering vara lämpligt. För insamling av embryon i skeden än kärnkraft cykel 14, de andra inkubationstider embryon vid 25 ° C i steg 1.4 behöver justeras enligt följande: nukleära cykel 12, 70 min; nukleära cykel 13, 90 min; 3 – 4 hpf, 3:30 h.
Under divisionerna 13 klyvning (etapp 1-4), fördubblas kärnor tätheten ungefär med varje division. Atomkärnor kan lätt identifieras genom sin ljusa GFP-fluorescens. Under Mitos, andra-PCNA ligger inte i kärnan och dess signal är spridda över hela embryot. Denna funktion gör att identifiera embryon som genomgår en synkron klyvning division möjligt. För att studera kromatin konformation, är dessa mitotiska embryon oftast inte önskvärt, eftersom den mitotiska organisationen av kromatin är drastiskt annorlunda än de interphase organisation35. Det är möjligt att anpassa protokollet specifikt Markera embryon som genomgår en synkron mitotiska division. I detta fall endast embryon med spridda, icke-nukleära distribution av andra-PCNA bör hållas, och alla andra embryon ska kasseras. Eftersom den nukleära tätheten inte kan fastställas, måste alternativa metoder till scenen embryon av deras morfologi i överförda ljusmikroskopi användas. Förekomsten av pole celler och atomkärnor embryo periferi indikera att embryot har avslutat minst kärnkraft cykel 9, medan synliga cellularization i periferin indikerar nukleära cykel 1412.
Hi-C experiment kan utföras framgångsrikt med ett brett urval av restriktionsenzym5. Nuvarande metoder använder vanligtvis enzymer som känner igen antingen en 4-base-sekvens, till exempel MboI eller en 6-base erkännande webbplats, till exempel HindIII. Fördelen med 4-base fräsar över 6-base fräsar är att de erbjuder högre potentiella upplösning, gett tillräckligt sekvensering djup och en mer jämn täckning av begränsning platser över genomet. Det finns ingen tydlig fördel att välja en 4-base cutter över ytterligare5,23,36,37. De två vanligaste enzymerna, MboI och DpnII, igen båda samma GATC erkännande plats. DpnII är mindre känslig för CpG metylering, som inte berör i Drosophila. Det protokoll som presenteras här kan även slutföras med DpnII som ett restriktionsenzym. I avsnitt 4.2. restriktionsenzym och buffert måste justeras för DpnII kompatibilitet, enligt tillverkarens rekommendationer.
Om fragmentet storleken av sekvensering biblioteket avviker väsentligt från det område som visas i figur 2A, kan kluster bildas under sekvensering vara mindre effektiv eller misslyckas helt. I det här fallet storleksfördelning efter klippning bör kontrolleras och klippning parametrar justeras därefter. Toppar i fördelningen av DNA-fragment av mycket små ( 1000 bp) storlekar indikerar problem med storlek urval, såsom carry över av pärlor eller supernatanten som ska kasseras. Ofta dessa bibliotek med små toppar på dessa oönskade storlekar, såsom den på bilden, är fortfarande sekvenserade framgångsrikt med endast en smärre minskning klustring effektivitet.
Höga priser för PCR dubbelarbete bör undvikas eftersom detta minskar drastiskt antalet användbara sekvensen läser. Graden av PCR dubbletter är direkt relaterad till mängden ingående material. Med mer input därför avhjälper vanligtvis problem med PCR dubbelarbete.
Högre antal läsningar filtreras på grund av Läs orientering ()figur 2B) indikera otillräcklig matsmältningen, vilket kan vara resultatet av att använda för lite enzym, för mycket insatsmaterial eller ofullständig homogenisering av embryon.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen finansierades av Max Planck Society. C.B.H. stöddes av ett stipendium från den internationella Max Planck forskarskolan – molekylär biomedicin. Vi tackar Shelby Blythe och Eric Wieschaus för vänligt att ge andra-PCNA Drosophila melanogaster linjen.
Biotin-14-dATP | Life Technologies | 19524016 | |
MboI | New England Biolabs | R0147L | |
DNA Polymerase I Klenow Fragment | New England Biolabs | M0210L | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher | EL0012 | T4 DNA Ligase Buffer included |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
Proteinase K | AppliChem | A4392 | |
GlycoBlue | Life Technologies | AM9516 | |
Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors | Roche | 5892791001 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335 | Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England Biolabs | E7645 | End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit |
Covaris S2 AFA System | Covaris | ||
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030108051 | |
Falcon cell strainer 100 µm | Corning | 352360 | Embryo collection baskets |
37% formaldehyde | VWR | 437536C | |
Heptane | AppliChem | 122062.1612 | |
M165 FC fluorescent stereo microscope | Leica | ||
M165 FC DFC camera | Leica | ||
Metal micro pestle | Carl Roth | P985.1 | Used to lyse embryos in step 4.1.4 |
RNase A | AppliChem | A3832,0050 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65002 | Streptavidin coated magnetic beads |
Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
eGFP-PCNA flies | Gift from S. Blythe and E. Wieschaus | ||
Sodium hypochlorite 13% | Thermo Fisher | AC219255000 | |
Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology | AppliChem | A4577 | |
NaCl | AppliChem | A2942 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
SDS for molecular biology | AppliChem | A2263 | |
10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
PCR Nucleotide Mix | Sigma-Aldrich | 11814362001 | Unmodified dCTP, dGTP, dTTP |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
EDTA 0.5M solution for molecular biology | AppliChem | A4892 | |
Sodium acetate 3M pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | Magnetic stand |
Intelli-Mixer RM-2L | Omnilab | 5729802 | Rotator |
ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | Mixer |
Small Embryo Collection Cages | Flystuff.com | 59-100 | Egg collection cage |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000413 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
PCR tube strips | Greiner Bio-One | 673275 | |
NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | T4 DNA Polymerase buffer |