Här presenterar vi ett standardiserat protokoll för att mäta nasal potentialskillnaden (NPD). Cystisk fibros transmembrane conductance regulator (CFTR) och epitelial natrium kanal (ENaC) funktion utvärderas av förändringen i spänningen över nasal epitelet efter superfusion av lösningar som ändra ion kanal aktivitet, som ger en effektmåttet.
Vi beskriver en standardiserad mätning av nasal potentialskillnaden (NPD). Den här tekniken cystisk fibros transmembrane conductance regulator (CFTR) och funktionen epitelial natrium kanal (ENaC) övervakas av förändringen i spänning över nasal epitelet efter superfusion av lösningar som ändra jonkanal verksamhet. Detta aktiveras genom mätning av potentialskillnaden mellan den subkutana facket och luftvägarna epitelet i näsborren, utnyttja en kateter i kontakt med den sämre nasalen Concha.
Testet tillåter mätning av stabil baslinje spänningen och de successiva netto spänningsändringar efter genomblödning av 100 µM amilorid, en hämmare av Na+ reabsorption i Ringers lösning; en klorid-fri lösning som innehåller amilorid till drive klorid sekretion och 10 µM isoproterenol i en klorid-free lösning med amilorid att stimulera de cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP)-beroende klorid konduktans relaterade till CFTR.
Denna teknik har fördelen att demonstrera två viktiga komponenter att upprätta hydratisering av airway surface vätskan av respiratoriskt epitel, ENaC och CFTR elektrofysiologiska egenskaper. Därför, det är en användbar forskningsverktyg för fas 2 och bevis på konceptet prövningar av agenter som rikta CFTR och ENaC verksamhet för behandling av cystisk fibros (CF) lungsjukdom. Det är också en viktig uppföljning förfarande för att fastställa CFTR dysfunktion när genetisk testning och svett testa är tvetydiga. Till skillnad från svettklorid är testet relativt mer tidskrävande och kostsamma. Det krävs också utbildning av operatörer och expertis för att genomföra testet effektivt. Inter – och mellan – individuell variabilitet har rapporterats hos denna teknik speciellt hos unga eller samarbetsovilliga patienter. För att bistå med denna oro, har tolkning förbättrats genom en nyligen validerade algoritm.
Det övergripande målet med denna metod är att mäta nasal potentialskillnaden (NPD) som syftar till att undersöka trans-epitelial ion transport i vivo1. Denna teknik tillåter mätning av natrium (Na+) och klorid (Cl–) transport. NPD har använts som ett verktyg för forskning sedan slutet av 1980 och godkändes 1998 som en diagnostisk procedur av cystisk fibros Foundation (CFF) samförstånd uttalande2 och 2017 i cystisk fibros Foundation (CFF) samförstånd diagnostiska riktlinjer 3. faktiskt biologiska CFTR dysfunktion, vilket är orsaken till CF, framgår av en ökad Na+ absorption vid det apikala membranet och en defekt i Cl– sekretion. Detta funktionella test ger fördelen av en ytterligare diagnos verktyg när genetik är inkonklusiva hos patienter med obestämt mellanliggande svett test resultat3. Även om denna information kan även erhållas av intestinal nuvarande mätning biopsier (ICM), ICM är dock endast tillgänglig i några centra globalt och ytterligare behöver standardisering. NPD är mer tillgänglig i ungefärligt 60 globala centers och dessutom riktar respiratoriskt epitel som är den främsta platsen av sjukdomen.
Med tanke på den information som uppges på CFTR aktivitet, används det också i proof-of-concept studier som syftar till att bedöma funktionella restaurering av CFTR-proteinet i modulatorn terapier4,5,6,7, 8. Ja, data från studier med CFTR mRNA/gen redigering, CFTR förstärkare och corrector terapier, markera betydande ändringar i Cl– och Na+ transporter med terapi6,9 och bekräftar att NPD kan vara en lyhörd endpoint i kliniska prövningar. Eftersom vi saknar känsliga kliniska effektmått kunna upptäcka en subtil förändring i patientens kliniska status på kort sikt, kan detta prekliniska biomarkör vara mycket informativ. Fältet av CFTR modulator terapier breddar snabbt och vi behöver omgående tester i vivo som klarar att snabbt tolka aktiva föreningar innan du går till stora fas 3 studier10.
Den fysiologiska grunden för tekniken är baserad på mätning av potentialskillnaden mellan luftvägarna epitelet i näsborren och subkutan facket. Ion kanal aktiviteter utforskas genom att mäta stabil maximal baslinje potentialskillnaden (PD), dess förändringar efter blockerar ENaC relaterade Na+ absorption och körning Cl– sekretion via olika apikala Cl– transportörer inklusive CFTR. CFTR dysfunktion framgår potentialskillnaden vid stimulering av Cl– sekretion via en cAMP beroende av vägen av en minimal förändring och en ökad ENaC medierad Na+ absorption som upptäcks av en mer negativ baslinje potentiella skillnad och en förbättrad respons på amilorid. Den mekanistiska grunden för CF kontra normal PD sammanfattas i figur 1.
Figur 1: sammanfattande figur jonkanal aktivitet. (A) Ion aktivitet i den respiratoriskt epitel visar balanserad aktivitet ENaC och CFTR i normala individer och (B) förlust av CFTR verksamhet vilket resulterar i ökad ENaC medierad natrium transporter och minskad CFTR beroende av klorid transport. ENaC: epitelial natrium kanal, Na+: natrium, CFTR: cystisk fibros transmembrane regulator, CL–: natriumklorid, mV: millivolt, PD: potentialskillnaden, min: minut/s vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Detta test visar dock en viss variation både vid upprepade mätningar inom samma patient och bland patienter med samma genotyp. Detta är av yttersta vikt att underlätta tolkningen av ändringarna efter modulator behandling. Dessutom saknar vi fortfarande validerade tröskelvärden diskriminera mellan CF och friska försökspersoner. Detta kan bero delvis på skillnader mellan tillgängligheten av kliniska faciliteter och de tekniker som används. Därför pågår en betydande internationell insats syftar till standardisering av testet. Både oss CFF-TDN (cystisk fibros Foundation-Therapeutics Development Network) och riskkapitalfonderna-CTN (Europeiska cystisk fibros Society-kliniska prövningar Network) skapade en NPD normalförfarande (SOP) för användning i multicenter och forskning prövningar. Denna senaste kollaborativt arbete av CTN och TDN har resulterat i en kombination, internationella SOP, sammanföra expertis av CTN och TDN (2014)11. Detta dokument presenterar de protokoll och testa teknikerna för att anställa NPD för CF diagnos eller utredare-initierade proof-of-concept prövningar. Varje center implementera tekniken ansvarar för tillämpning på dess institutionella mänskliga forskningsetisk kommitté för godkännande.
Figur 2: Schematisk bild av hela rekommenderas NPD setup. Observera att den rekommendera installationen visas, inklusive sekventiell perfusion pumpar och inställningen för 4-stopp-kuk-serien. Specifika anslutningar och exempel på komponenter visas i SOP. (Diagram modifierad med tillstånd från Solomon, G.M. bröstet, 2010-13) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det allmänna experimentella flödet beskrivs i figur 2, whereby NPD mäts mellan utforska bron placerad på epitel yta och referens bron placeras i subkutan rymden, båda anslutna till elektroder och en hög impedans voltmeter.
Detta säkerställs genom 2 olika system: det finns 2 godtagbar referens elektrod uppställningar: (i) balanserad Ag/Granulatfyllda elektroder och ett elektrokardiogram (EKG) grädde-fylld bro ansluten till subkutan utrymmet med liten nötning eller (ii) mättad kalomel Half-cells och en agar fyllde 22 till 24-gauge nål introducerade subkutant. Kontakten till nässlemhinnan är aktiverad som en dubbel lumen kateter. En lumen är fylld med agar eller ECG grädde och ansluten till mätning elektroden, andra tillåter perfusion på nässlemhinnan av olika lösningar.
Spetsen av utforska slangen placeras på slemhinnan i luftvägarna under den sämre nasala Concha (figur 3).
Figur 3: placering av utforska slangar till respiratoriska slemhinnan. (A) externa vyn visar placering. (B) Rhinoscopic vy visar placering. (C) Diagram som visar det anatomiska läget för placering av katetern. PD: potentialskillnaden
För att studera PD svar på flera läkemedel, tillämpas de superfusion lösningarna via andra lumen av katetern. I området i närheten finns det flera viktiga steg när det gäller förberedandet och genomförandet av NPD mätningar, som beskrivs nedan i protokollet, från inledande förberedelser genom att analysera data.
Efter beredning av lösningar och elektroder möjliggör adekvat kvalitetstester av elektroder och katetrar grundläggande utförandet av testet. Basala mätningar görs längs sämre Concha, som tillåter val av den bästa platsen för mätning, oftast som med mest negativa mätningen. Sedan bestämma sekventiell perfusioner Na+ (ENaC) och Cl– (CFTR-beroende) ion flux via en förändring av spänningen över det nasala epitelet.
In vivo, NPD ger en unik mätning som kan utföras flera gånger på basis av längsgående och visar att med upprepade mätningar, liknande längsgående resultat observeras på en tredagars och individuell basis14, 15. Det finns starka bevis att NPD har utmärkt diskriminering giltighet för att skilja CF från icke-CF. 25 studier visade genomgående en statistiskt signifikant skillnad i Cl– och Na+ konduktans mellan patienter med CF och friska kontroller10. Medan flera tidigare utvecklade index visar denna kapacitet, räknar vi med att nya uppdateringar är nödvändiga med tanke på senaste standardiseringar av metod7,8.
Modifieringar och felsökning
Detta test kräver flera viktiga steg för att säkerställa noggranna mätningar. Detta inkluderar elektroder och katetrar slutna offset för att säkerställa att systemet fungerar rekommenderade normer. Patienter måste vara stilla och avstå från att prata eftersom det minimerar artefakter och katetern se om de rubbas. Detta gör att testet är svårt i icke samarbetsvilliga patienter och tekniken har endast rapporterats i en studie på barn under 6 års ålder7.
Före inspektion av nasal epitel är nödvändigt att säkerställa att det finns inga skorpor eller slem på epitelet, vilket kan påverka mätningarna.
Mycket viktigt, måste det påpekas att platsen för placeringen av katetern är föremål för debatt. SOP presenteras här använder tredjeparts mätning under sämre Concha (IT). Placeringen av katetern under det. har standardiserats och bedrivs i multicenter studier och därför är detta Rekommenderad teknik. Mätning under det. utförs med sida-håls katetern, som kan vara svårt att upprätthålla i fast kontakt med nässlemhinnan, samtidigt som de är i kontakt med lösningarna. Andra grupper kan mäta PD på nasal golvet, som är tekniskt enklare. Ännu viktigare, visade Vermeulen (2011) att 2 metoderna är jämförbara16.
Uppvärmningen av lösningarna förblir diskussion mellan Europeiska och amerikanska-centers17,18. Det har förespråkat att använda lösningar vid 37 ° C i stället för 22 ° C ökar observerade totala klorid svaret med cirka 25% och isoproterenol-beroende klorid svaret ungefär 95%18. Men ökar uppvärmningen variabilitet, enligt bedömning av en större standardavvikelse av totala klorid svar17. Därför, eftersom uppvärmningen lösningarna är ytterligare en faktor av variabilitet, rekommenderas inte att värma lösningarna om det inte krävs på grundval av studien.
Vi har tidigare jämfört både av elektroden tekniker och fann att både Granulatfyllda och kalomel elektrodsystem drivs på samma sätt i basal som stimulerad strömmar i normala individer13.
Begränsningar av tekniken
Detta test är föremål för betydande inomindividuella variationen. Variabilityen av scoring är särskilt vanligt hos patienter med obestämt tracings och detta skall redovisas i diagnostiska program19. Faktorer av variabilitet är akut övre luftvägsinfektion, omfattande näspolyper, tidigare sinus kirurgi och CF-relaterade inflammation, som minskar dess specificitet och känslighet20,10. Dessutom, tolkning av tracings kan vara olika mellan läsarna, men expert läsare visar utmärkt överenskommelse av kvantitativa scoring och tolkningsbarhet i CF och icke-CF tracings, kontrasterande med en betydande variabilitet i de förtroende av spårning19.
Inneboende variabilitet kontra betydande tröskelvärden
Mycket viktigt, fysiologiska variabilityen av mätningen är betydande, vilket illustreras i olika studier10, såsom de CFTR genterapeutiska prövningar som uppvisade betydande fluktuationer i förändringar i klorid totala transport och amilorid sträcker sig21,22. Tvärsnittsdata utvärdering tyder på att noll Cl– plus isoproterenol svar över tröskelvärdet på -5 -7 mV är cut-off mellan CF och icke-CF patienter10.
Vi saknar dock tydlig kunskap om omfattningen av förändringen av denna parameter som representerar en effektiv CFTR korrigering i fas-II studier med sjukdomsmodifierande terapier. För att bedöma enskilda svaret, kan upprepade tester övervakning att bemöta en intervention krävas att skilja betydande förändringar från inneboende variabilitet. Mycket viktigt, behöver framtida långsiktiga studier med sjukdomsmodifierande läkemedel Visa att förbättring av CFTR funktion korrelerar med förbättring av kliniskt relevanta resultat eller surrogat utfall (såsom förbättring av FEV1) CF sjukdom. Faktiskt, en nyligen fas II ivakaftor studie visade märkt klinisk nytta trots en liten förbättring i klorid sekretion23.
Sådana studier hjälper till att fastställa om en cut-off värdet av förbättring i trans-epitelial Cl–konduktans kan vara en surrogat parameter för klinisk nytta. Detta skulle vara en viktig parameter för att styra utvecklingen av CFTR ändra terapier.
Betydelse med avseende på befintliga metoder: svett Test och Intestinal aktuella mätningar (ICM)
Hos patienter med ” tvivelaktiga ” cystisk fibros, som bedöms av en mellanliggande svett Cl– koncentration mellan 30 och 60 mM, NPD sammansatta noter som tillhandahålls ett mycket känsliga verktyg för att diagnostisera patienter lika ” CF-sannolikt ” och ” CF-osannolikt ”10 . Intestinal strömmätning (ICM), vilket ger en ex vivo -mätning av net Cl– flöden över rektal epitelet, tillåter också bestämning av CFTR restfunktion med en hög känslighet eftersom CFTR uttrycks mycket i Detta epitel.
Med tanke på modifiering av CFTR funktionen av CFTR modulatorer, förhållandet mellan dessa olika CFTR biomarkör förändringar är i dagsläget oklart. Även om senaste arbete baserat på bestäms ivakaftor att NPD och svett test är korrelerade4, det har ännu inte fastställts om en mätning i luftvägarna är en bättre prediktor för respiratoriska resultatet än exempelvis, svett testa24 , 25 eller förändring i ICM. Modifieraren droger kan också skiljer sig åt, i sin orgel specifika efficacies. När det gäller NPD är det viktigt att notera att förändringar i basala PD och amilorid svar uttrycka Na+ transport, medan förändringar i 0 Cl– och isoproterenol reaktion express Cl– transport. Det är ännu för att konstatera vilken av dessa är viktigare för sjukdom förbättringen.
Framtida tillämpning av denna teknik
Användningen av denna teknik förväntas utanför fältet CF. Eftersom denna teknik är unikt lämpade för att demonstrera Na+ och Cl– jonkanal, kan det användas för att demonstrera dysfunktion i airways sjukdomar inklusive astma26, kronisk bronkit27, icke-CF-bronkiektasi28 och återkommande pankreatit29. Ändringar av denna teknik har dessutom använts i de nedersta luftvägarna (LAPD) för att demonstrera nedre luftvägarna-fokuserad CFTR dysfunktion i kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol) patienter med kronisk bronkit30.
NPD ger en känslig i vivo biomarkör för CFTR funktion, som kan användas för både diagnos och dessutom för proof-of-concept studier som syftar till att korrigera CFTR och ENaC kanal aktivitet i translationell forskning. Detta gör längsgående bedömning av trans-epitelial funktion och håller löftet som en strategi för personlig medicin att skräddarsy den effektivaste corrector för varje patient med CF.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av den funktionsdugliga gruppen för CFTR funktion av Standardization kommittén (kliniska prövningar nätverk, Europeiska cystisk fibros Society) och nationella resurser Center Working Group (Therapeutics Development Network, cystisk fibros Foundation). Ytterligare stöd tillhandahölls av stiftelsen CF (Clancy FY09 till GMS) och NIH (DK072482 till SMR och GMS).
KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital) | Fisher Scientific | ||
Powerlab 4/30 | AD Instruments | ||
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier | AD Instruments | ||
IS0-Z isolation headstage for BMA-200 | AD Instruments | ||
Windows compatible PC – Minimum requirements of Windows XP or higher | Various | ||
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher | AD Instruments | ||
ECG electrode (ground for study subject) | Hospital standard | ||
2 mini calomel reference electrodes | Fisher Scientific | 13-620-79 | |
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm | Spectrum | ||
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.) | Hospital standard | ||
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode | BIOPAC Systems | UNSHLD-EL258 | |
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm | SLE Instruments | ||
Signacreme® Conductive Electrode Cream | Fisher Scientific | Parker Labs ref # 17-05 | |
Skin abrasion device | PROMED Feeling | Ref 374901 | |
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs | Ash Instruments | ||
Becton Dickinson PE 50 tubing | Fisher Scientific | 427411 | |
Becton Dickinson PE 90 tubing | Fisher Scientific | 427421 | |
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD | Fisher Scientific | 508-007 | |
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m) | 3M | 1530-1 | |
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US | Marquat | I0202US | |
1" X 10 yards silk tape | 3M Durapore | 1538-1 | |
IV extension tubing (30", 50/box) | International Limited | IMN30 | |
Three-way stopcock (50/box) | Medex | MX5311L | |
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50pk; 0.22-micron or smaller filters; or equivalent) | Fisher Scientific | 09-926-7 | |
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site) | Fisher Scientific | 427564 | |
Becton Dickinson 23G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 x 19 mm; 50U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site) | Fisher Scientific | 367283 | |
Becton Dickinson Syringe 60 ml without needle Luer-Lok tip (40/Box) | Fisher Scientific | 309653 | |
Becton Dickinson Syringe 10 ml without needle Luer-Lok tip (100/Box | Fisher Scientific | 309604 | |
Single use sterile wipes (per institutional availability) | Hospital standard | ||
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent) | Fisher Scientific | ||
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 litre volumes acceptable) | Fisher Scientific | 430624 | |
Buffer Cert Ph 10.00 (1L Sn04332) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
Buffer Cert Ph 4.00 (1L Sn04327) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
Buffer Cert Ph 7.00 (500 ml Sn04328) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
Disposable underpads (Blue Pads; 23"X36" 150/Box; or equivalent per hospital standard) | SureCare | ||
23G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6×19 mm; 50U/box) | Becton Dickinson | 367283 | |
Difco Laboratories Agar (Noble 100g 0142-15-2; or equivalent) | Fisher Scientific | ||
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent) | Fisher Scientific | ||
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery | Fisher Scientific | ||
Head and chin rest (or equivalent; optional) | Richmond Products, Inc | 629R | |
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting (or equivalent) | Fisher Scientific | No. 791 | |
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE | |||
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl | Spectrum | Formula Weight: 58; Size: 500 gm | |
Calcium Chloride CaCl2•2H2O – USP | Spectrum | Formula Weight: 147; Size: 500 gm | |
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP | Spectrum | Formula Weight: 203; Size: 500 gm | |
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, K2HPO4 – USP | Spectrum | Formula Weight: 174; Size: 500 gm | |
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4) | Spectrum | Formula Weight: 136; Size: 500 gm | |
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt) | Spectrum | Formula Weight: 218; Size: 500 gm | |
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder) | Spectrum | Formula Weight: 430; Size: 500 gm | |
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous) | Spectrum | Formula Weight: 234; Size: 500 gm | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O | Spectrum | Formula Weight: 246; Size: 500 gm | |
Amiloride HCl – USP | Spectrum | Formula Weight: 302; Size: 5gm | |
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt) | Spectrum | Formula Weight: 551; Size: 5gm | |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O | Spectrum | Formula Weight: 203; Size: 500 gm | |
Double-distilled water (ddH2O) | Hospital Pharmacy | Formula Weight: NA; Size: 1 L | |
Isoproterenol HCL Injection – USP 1 mg/5 ml ampule | Hospital Pharmacy | Formula Weight: 248; Size: single use | |
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation | Hospital Pharmacy | Formula Weight: NA; Size: 5 L |