एक अंडाकार आकृति में चिकित्सा परीक्षण-सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के लिए 3 डी सेल संस्कृति मॉडल आधारित
Summary
हम एक अंडाकार आकृति के विकास का वर्णन आधारित, तीन आयामी इन विट्रो मॉडल है कि हमें सेल लाइनों पर सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के लिए प्रयोगात्मक चिकित्सा परहेजों के मौजूदा मानक परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है, चिकित्सा के मूल्यांकन में लक्ष्य भविष्य में मानव नमूनों से प्राथमिक कोशिकाओं पर संवेदनशीलता और प्रतिरोध ।
Abstract
उन्नत और आवर्तक सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSCC) के लिए वर्तमान उपचार के विकल्प विकिरण और chemo-विकिरण दृष्टिकोण के साथ या सर्जरी के बिना संलग्न । जबकि प्लेटिनम आधारित कीमोथेरेपी परहेजों वर्तमान में प्रभावकारिता के मामले में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करते है और मामलों के विशाल बहुमत में दिए गए हैं, नई कीमोथेरेपी परहेजों, अर्थात् immunotherapy उभर रहे हैं । हालांकि, प्रतिक्रिया दरों और चिकित्सा प्रतिरोध तंत्र या तो chemo आहार के लिए भविष्यवाणी करने के लिए कड़ी मेहनत कर रहे है और अपर्याप्त समझ में रहते हैं । chemo और विकिरण प्रतिरोध तंत्र के व्यापक रूपांतरों तिथि करने के लिए जाना जाता है । इस अध्ययन में एक मानकीकृत, उच्च- विट्रो में प्रवाह के विकास का वर्णन करने के लिए विभिंन चिकित्सा परहेजों को HNSCC सेल लाइन की प्रतिक्रिया का आकलन है, और उंमीद है व्यक्तिगत ट्यूमर के लिए एक भविष्य के उपकरण के रूप में व्यक्ति के रोगियों से प्राथमिक कोशिकाओं पर चिकित्सा. परख हमारे तृतीयक देखभाल केंद्र में HNSCC रोगियों के लिए गुणवत्ता नियंत्रित मानक एल्गोरिथ्म में एकीकृत किया जा रहा करने के लिए बनाया गया है; हालांकि, यह भविष्य की पढ़ाई का विषय होगा । तकनीकी व्यवहार्यता वास्तविक रोगियों से ट्यूमर बायोप्सी से प्राथमिक कोशिकाओं के लिए होनहार लग रहा है । नमूने तो प्रयोगशाला में स्थानांतरित कर रहे हैं । बायोप्सी यांत्रिक एंजाइमी पाचन के बाद अलग कर रहे हैं । कोशिकाओं तो अल्ट्रा कम आसंजन सेल संस्कृति शीशियों कि reproducible, तीन आयामी, अंडाकार आकृति के आकार का सेल कंपनियों के मानकीकृत और सहज गठन को बढ़ावा देने में हो रहे हैं । Spheroids तो chemo-विकिरण प्रोटोकॉल और immunotherapy प्रोटोकॉल की जरूरत के रूप में उजागर होने के लिए तैयार हैं । अंतिम कोशिका व्यवहार्यता और अंडाकार आकृति आकार चिकित्सा संवेदनशीलता के संकेतक है और इसलिए भविष्य में विचार में तैयार किया जा सकता है रोगियों की संभावना चिकित्सा प्रतिक्रिया का आकलन । इस मॉडल को सिर और गर्दन के कैंसर के लिए निजीकृत चिकित्सा की दिशा में एक मूल्यवान, लागत कुशल उपकरण हो सकता है ।
Introduction
सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSCC) श्लैष्मिक मानव papillomavirus (एचपीवी) संक्रमण से जुड़े रोगजनन, अत्यधिक निकोटीन और शराब की वजह से मामलों के बहुमत के बगल में एक बढ़ती घटनाओं के साथ दुनिया भर में छठे सबसे आम कैंसर है उपभोग 1,2. जबकि छोटे ट्यूमर और पूर्व इनवेसिव चरणों आमतौर पर शल्य चिकित्सा उत्पाद के साथ अच्छी तरह से इलाज कर रहे हैं, आमतौर पर गर्भाशय ग्रीवा लिम्फ नोड विच्छेदन के साथ संयुक्त, उन्नत चरण और आवर्तक HNSCC के लिए उपचार के साथ आक्रामक ट्यूमर आक्रमण के कारण चुनौतीपूर्ण रहता है मेटास्टेटिक प्रसार और विकिरण और कीमोथेरेपी के लिए प्रतिरोध प्रोटोकॉल3,4,5,6,7,8। हाल के अध्ययनों सेलुलर phenotype की एक उच्च परिवर्तनशीलता का सुझाव देते हैं, और परिसंचारी और प्रसार ट्यूमर कोशिकाओं के उप लक्षण वर्णन सिर्फ9,10शुरू कर दिया है । एक ठोस, समान ट्यूमर मास के पहले विश्वास पिछले वर्षों में हाल के अध्ययनों के प्रकाश में संशोधित किया जाना था11,12,13,14। ट्यूमर लक्षण वर्णन और कुंजी उत्परिवर्तनों की पहचान के लिए वर्तमान दृष्टिकोण कई जीन है कि चिकित्सा प्रतिरोध के साथ जुड़े प्रतीत होते हैं, लेकिन एक लागत गहन दृष्टिकोण रहने की पहचान सकता है । इसके अलावा, जीनोटाइप का ज्ञान जरूरी phenotype और उसके इलाज की प्रतिक्रिया के एक विश्वसनीय भविष्यवाणी की अनुमति नहीं है ।
उन्नत चरण और आवर्तक रोग के लिए समग्र और रोग मुक्त अस्तित्व में सुधार लाने में कुछ प्रगति हुई है । निकोटीन के लिए-के रूप में अच्छी तरह से वायरस से जुड़े कार्सिनोमा, सर्जरी के अलावा वर्तमान उपचार के विकल्प आक्रामक विकिरण और प्लेटिनम आधारित कीमोथेरेपी परहेजों संलग्न हैं । वहां एचपीवी के बीच अलग प्रतिक्रिया दरों के लिए निहितार्थ नकारात्मक और सकारात्मक कार्सिनोमा गया है; हालांकि, यह अभी तक सामान्य चिकित्सा दिशानिर्देशों में कोई परिवर्तन करने के लिए लीड नहीं है । विकिरण और कीमोथेरेपी के प्रति प्रतिरोध सभी ट्यूमर चरणों में एक व्यापक घटना है और प्लेटिनम आधारित रसायन चिकित्सा के लिए मौजूद है और साथ ही लक्षित थेरेपी के लिए (विरोधी EGFR; एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर) और हाल ही में उभरते चौकी निषेध15। अप्रभावी विकिरण और कीमोथेरेपी dysphagia के मामले में महत्वपूर्ण रोगी रुग्णता की एक उच्च लागत पर आते हैं, mucositis, शुष्क मुँह और दूसरों के बीच गुर्दे या हृदय समारोह की कमी के जोखिम. चिकित्सा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी प्रत्येक व्यक्ति रोगी के लिए एक सामांय चिकित्सा अवधारणा के निर्णय से पहले महत्वपूर्ण लक्ष्य है, अनावश्यक उपचार अवधारणाओं, दुष्प्रभावों और लागत को रोकने लगता है ।
हम मौजूदा मानक chemo-विकिरण है कि नियमित रूप से और गुणवत्ता नियंत्रित oncologic उपचार एल्गोरिथ्म में एक तकनीकी खड़े बिंदु से एकीकृत किया जा सकता है की ओर व्यक्तिगत रोगी के उपचार संवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए एक मॉडल स्थापित करने की मांग की । दूर लक्ष्य भारी बदल और वृद्ध सेल लाइनों का उपयोग कर के बिना मॉडल का उपयोग किया गया था, क्योंकि वे खराब उनकी परिवर्तनशीलता और विविधता के बिना वास्तविक मानव ट्यूमर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व के रूप में हम अब जानते हैं, जबकि प्रोटोकॉल की स्थापना के विभिंन सेल लाइनों में किया गया था । केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल लाइनों से स्वतंत्र होने के लिए, हम हाल ही में सफलतापूर्वक अपनी सतह और सीमित मार्ग पर संरक्षित सेलुलर मार्करों के साथ मानव ट्यूमर नमूनों से प्राथमिक HNSCC कोशिकाओं से “PiCa” नामक एक मध्यवर्ती सेल लाइन उत्पन्न 16. इस PiCa सेल लाइन सड़क पर मॉडल के विकास के लिए एक तैयारी के रूप में फिर बाद में ट्यूमर बायोप्सी से ताजा मानव कैंसर कोशिकाओं के साथ परीक्षण के बाद सेवा करनी चाहिए । यह दिखाया गया है कि तीन आयामी कोशिका संस्कृतियों में कोशिकाओं को अलग ढंग से और अधिक vivo में-monolayers17,18,19,20 में बढ़ रही उन लोगों की तुलना में कैंसर दवाओं के प्रशासन के लिए की तरह प्रतिक्रिया ,21, मुख्य रूप से प्रवासी और कुछ सेल सबसेट के उप-विभेदक गुणों के संरक्षण के कारण22,23,24। यहां, हम एक अंडाकार आकृति के प्रोटोकॉल का वर्णन आधारित, तीन मध्यवर्ती सेल लाइनों और प्राथमिक मानव स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं और तरीके कैसे सिर और गर्दन सर्जन और ऑन्कोलॉजिस्ट के कैंसर के इलाज में इस तरह के एक मॉडल को एकीकृत से आयामी मॉडल ( चित्र 1) ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सेल सस्पेंशन से reproducible spheroids उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करने में सक्षम थे, दोनों सेल लाइनों के लिए और, प्रारंभिक प्रयोगों में, प्राथमिक मानव ट्यूमर कोशिकाओं. हम पहले दो पहले वर्णित तरीकों क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के म्यूनिख विश्वविद्यालय के अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (FöFoLe परियोजना-no.: 789-781).
Materials
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
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