Vérifier dans un modèle de Culture cellulaire 3D basé sur l’ellipsoïde tête et cou, carcinome épidermoïde de la thérapie
Summary
Les auteurs décrivent l’évolution d’un modèle tridimensionnel, axée sur le sphéroïde le in vitro qui permet de tester la norme actuelle des régimes de thérapie expérimentale pour la tête et du cou carcinome épidermoïde sur des lignées cellulaires, visant à évaluer la thérapie sensibilité et résistance des cellules primaires de spécimens humains à l’avenir.
Abstract
Les options thérapeutiques actuelles pour avancé et récurrente de tête et cou carcinome spinocellulaire (HNSCC) joindre rayonnement et approches de la chimio-rayons avec ou sans chirurgie. Alors que les chimiothérapies à base de platine actuellement représentent l’étalon-or en termes d’efficacité et sont indiquées dans la grande majorité des cas, les nouveaux schémas de chimiothérapie, à savoir l’immunothérapie font leur apparition. Toutefois, le taux de réponse et les mécanismes de résistance de thérapie pour chaque régime de chimio sont difficiles à prédire et restent insuffisamment compris. Grandes variations de chimiothérapie et radiation des mécanismes de résistance sont connues à ce jour. Cette étude décrit le développement d’un test standardisé, haut débit le in vitro pour évaluer réponse de lignée de cellules HNSCC à divers régimes de thérapie et j’espère que sur les cellules primaires de chaque patient comme un futur outil pour tumeur personnalisé thérapie. Le dosage est conçu pour être intégrée à l’algorithme standard de contrôle de la qualité pour les patients HNSCC à notre centre de soins tertiaires ; Toutefois, ce sera objet d’études futures. Faisabilité technique semble prometteuse pour les cellules primaires de biopsies de tumeurs de patients réels. Les échantillons sont ensuite transférées dans le laboratoire. Les biopsies sont séparées mécaniquement suivie par digestion enzymatique. Cellules sont ensuite cultivées en flacons de culture cellulaire ultra faible adhérence qui favorisent la formation reproductible, standardisée et spontanée des conglomérats de cellule en trois dimensions, en forme d’ellipsoïde. Sphéroïdes sont alors prêts à être exposés à des protocoles de chimio-rayons et protocoles d’immunothérapie au besoin. La taille de sphéroïde et de viabilité des cellules final sont des indicateurs de sensibilité de la thérapie et pourraient donc être tirées en considération à l’avenir pour évaluer la réaction probable de la thérapie des patients. Ce modèle pourrait être un outil précieux et rentable vers une thérapie personnalisée du cancer de la tête et du cou.
Introduction
Tête et cou carcinome épidermoïde (HNSCC) est le cancer le sixième plus répandu dans le monde entier avec une augmentation de l’incidence de la pathogenèse associée à une infection muqueuse virus du papillome humain (VPH), à côté de la majorité des cas causés par l’alcool et la nicotine excessive consommation 1,2. Tandis que les plus petites tumeurs et étapes pré-invasives sont en général bien traitables avec excision chirurgicale, généralement combinée avec dissection des ganglions cervicaux, traitement pour HNSCC avancée et récurrente demeure difficile en raison de l’invasion de tumeur agressive avec métastases et la résistance aux radiations et la chimiothérapie protocoles3,4,5,6,7,8. Des études récentes suggèrent une forte variabilité du phénotype cellulaire et caractérisation secondaire de circulation et les cellules tumorales disséminées vient de commencer9,10. La croyance antérieure d’une tumeur solide et uniforme masse devait être révisée à la lumière des études récentes dans le passé ans11,12,13,14. Les approches actuelles pour la caractérisation de la tumeur et l’identification de mutations clées pourraient identifier plusieurs gènes qui semblent être associés à la résistance de la thérapie, mais reste une démarche coûteuse. En outre, connaissance du génotype ne permet pas nécessairement une prévision fiable de phénotype et sa réponse au traitement.
Il y a eu quelques progrès dans l’amélioration de survie globale et indemne de la maladie pour la maladie avancée et récurrente. Pour la nicotine ainsi que carcinome associées aux virus, les options thérapeutiques actuelles en dehors de la chirurgie joindre rayonnement agressif et les chimiothérapies à base de platine. Il y a eu des répercussions sur les taux de réponse différents entre le carcinome HPV-négatif et positif ; Toutefois, cela n’a pas encore conduire à un changement en général directives de traitement. Résistance à la radiation et chimiothérapie est un phénomène répandu dans toutes les étapes de la tumeur et existe pour la chimiothérapie à base de platine aussi bien en ce qui concerne la thérapie ciblée (Anti-EGFR ; récepteur du facteur de croissance épidermique) et récemment émergentes checkpoint inhibition15. Chimiothérapie et la radiothérapie inefficace viennent à un coût élevé de morbidité importante de patients en termes de dysphagie, mucite, sécheresse de la bouche et risque de diminution de la fonction rénale ou cardiaque, entre autres. Prévoir avant l’intervention thérapeutique la décision d’un concept de thérapie générale pour chaque patient semble être l’objectif essentiel, empêchant les concepts de traitement inutile, les effets secondaires et les coûts.
Nous avons cherché à établir un modèle pour tester la sensibilité de traitement de chaque patient vers actuel chimio-rayonnement standard qui pourrait être intégrée dans l’algorithme de traitement oncologique régulière et contrôle de la qualité d’un point technique permanent. Le but lointain était d’utiliser le modèle sans utiliser des lignées de cellules fortement altérée et vieilli, car ils représentent mal les cellules tumorales humaines réelles sans leur variabilité et hétérogénéité comme nous le savons maintenant, alors que la mise en place du protocole a été faite dans diverses lignées cellulaires. Pour être indépendant qu’à partir de lignées cellulaires disponibles dans le commerce, nous avons généré récemment avec succès une lignée de cellules intermédiaire appelée « PiCa » de cellules primaires de HNSCC d’après des échantillons de tumeur humaine avec les marqueurs cellulaires conservées sur les passages de sa surfaces et limitées 16. lignée cellulaire PiCa ce devrait servir comme une préparation pour le développement du modèle sur la route à puis après essais avec des cellules cancéreuses humaines frais de biopsies tumorales. Il a été démontré que les cellules en trois dimensions cell cultures réagissent différemment et plus en vivo-comme à l’administration de médicaments contre le cancer que celles qui poussent dans les monocouches17,18,19,20 ,21, principalement en raison de la conservation des migrateurs et différenciation sous propriétés de certaines cellules des sous-ensembles22,23,24. Ici, les auteurs décrivent le protocole d’un modèle en trois dimensions, axée sur le sphéroïde de lignées de cellules intermédiaires et moyens et cellules humaines primaires carcinome spinocellulaire comment intègrent ce modèle dans le traitement du cancer de la tête et du cou chirurgien et oncologue ( Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons été en mesure d’établir un protocole pour générer des sphéroïdes reproductibles de suspensions cellulaires, pour les deux lignées cellulaires et, dans des expériences préliminaires, les cellules tumorales humaines primaires. Tout d’abord, nous avons évalué deux méthodes précédemment décrites et identifiées la ULA-méthode, une méthode où sont utilisées des plaques de culture avec ultra basse adhérence, pour être la plus sûre et plus fiable pour la génération des sphéroïdes tridim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par une subvention de l’Université de Munich (projet n° FöFoLe : 789-781).
Materials
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
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