السابقين فيفو التهاب الغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية أنثى والأنسجة اللمفاوية البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية 1 وهيستوكولتوري
Summary
العدوى للأنسجة البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز) السابقين فيفو يوفر نموذج ثلاثي الأبعاد قيماً من الفيروسات المرضية. هنا، يمكننا وصف بروتوكولا للعملية وتصيب عينات الأنسجة من اللوزتين البشرية وماكس تشويه الأعضاء التناسلية للإناث مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 والمحافظة عليها في الثقافة في واجهة الهواء السائل.
Abstract
هيستوكولتوريس السماح بدراسة التفاعلات بين الخلايا داخل الأنسجة البشرية، وأنها يمكن أن تستخدم لنموذج المضيف الممرض التفاعلات تحت ظروف المختبر التي تسيطر عليها. السابقين فيفو العدوى للأنسجة البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية (الفيروس)، وبين غيرها من الفيروسات، قد استخدمت بنجاح للتحقيق في أوائل المرض المرضية، فضلا عن منصة لاختبار مدى فعالية وسمية العقاقير المضادة للفيروسات. في هذا البروتوكول، نشرح كيفية معالجة وتصيب بفيروس نقص المناعة البشرية-1 الأنسجة explants من اللوزتين البشرية وعنق الرحم موكوساي، والحفاظ عليها في الثقافة على رأس الأسفنج الجيلاتين في واجهة الهواء السائل لمدة أسبوعين تقريبا. هذا الإعداد غير الاستقطاب الثقافة إلى أقصى حد الوصول إلى المواد المغذية في الثقافة المتوسطة والأكسجين، على الرغم من الفقدان التدريجي لسلامة الأنسجة والبنى الوظيفية ويظل قصره الرئيسي. يسمح هذا الأسلوب لرصد فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها والمرضية باستخدام العديد من التقنيات، بما في ذلك تحديدكم، قبكر، والتدفق الخلوي. من الأهمية، أن التغير الفسيولوجي بين المانحين الأنسجة، وكذلك بين اكسبلانتس من مناطق مختلفة من نفس العينة، قد تؤثر تأثيراً كبيرا على النتائج التجريبية. للتأكد من إمكانية تكرار نتائج نتيجة، من الأهمية بمكان استخدام عدد كاف من اكسبلانتس، replicates التقنية وشروط مراقبة مطابقة الجهات المانحة لتطبيع نتائج العلاجات التجريبية عند جمع البيانات من تجارب متعددة (أي .، ويجري استخدام أنسجة من مختلف الجهات المانحة) للتحليل الإحصائي.
Introduction
لا تراعي الثقافات monotypic خلية ثنائية الأبعاد، يشار هنا إلى التقليدية، للاتصال المكانية والوظيفية بين مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا التي تؤلف الأنسجة والأجهزة. هذا الجانب من الأهمية بالنسبة لنماذج تجريبية للمرض، كما تدخل في التفاعلات بين الخلايا التماثل الساكن هو العوامل الدافعة لجميع الأمراض. الأنسجة explants تتيح المزايا الرئيسية للنمذجة الصحة والمرض في البشر نظراً لأنها تحتفظ سيتوارتشيتيكتوري والعديد من الجوانب الفنية الهامة من الأجهزة كما الحال في فيفو، على الرغم من أن لكمية محدودة من الوقت1. على سبيل المثال، عند السابقين فيفو التحدي مع المستضدات التذكير، مثل توكسيد الدفتيريا أو الكزاز، تستجيب الأنسجة تونسيلار بإنتاج أجسام مضادة محددة مستضد2قوية. مثل أي أخرى السابقين فيفو النموذجي، هيستوكولتوري لها حدودها الخاصة: تقلب بين الوكالات المانحة، والأنسجة الاستقطاب وبقاء الأنسجة محدودة، وصعوبة في رصد الخلايا يتجاوز عمق مجهرية [كنفوكل]1. ومع ذلك، تظل explants الأنسجة البشرية نموذجا لاختيار دراسة العمليات المناعية التماثل الساكن والمسببة للأمراض في البشر، بما في ذلك التفاعلات المضيف الممرض و التدخلات العلاجية المحتملة3.
الأحداث الحرجة لأمراض فيروس نقص المناعة البشرية-1 تجري في الأنسجة. عدوى الغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية للإناث تمثل أغلبية جميع فيروس نقص المناعة البشرية-1 انتقال الأحداث في جميع أنحاء العالم4. الأنسجة اللمفاوية هو الموقع الرئيسي للنسخ المتماثل الفيروس أثناء الإصابة الحادة وتؤوي مجموعة كبيرة من الخلايا المصابة خفية5، وثباتها يمثل العقبة الرئيسية أمام تحقيق علاج6. تحدي الثقافة و السابقين فيفو الأنسجة اللمفاوية والأغشية المخاطية البشرية توفر بعض المزايا على النظم التقليدية القائمة على الخلايا المعزولة للدراسة لفيروس نقص المناعة البشرية-1. على سبيل المثال، يمكن أن تدعم خلايا الأنسجة-المقيم العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في غياب التنشيط الخارجية، بدلاً من الدم المحيطي الخلايا وحيدات النوى1. وقد يسمح باستخدام الأنسجة اللمفاوية explants فهم أفضل لبعض الآليات الرئيسية الكامنة وراء CD4 تي خلية استنزاف، أي، تأثير متفرجا7، وهي السمة المميزة للإصابة الحادة. الحفاظ على هياكل مثل المسام بالخليه في الأنسجة اللمفاوية8 والظهاره في الغشاء المخاطي الأعضاء التناسلية للإناث explants9 يوفر فرصة فريدة لدمج الميزات المكانية والوظيفية للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في هذه المواقع. وأخيراً، هيستوكولتوريس استخدمت بنجاح للنموذج ودراسة فيروس نقص المناعة البشرية-1 وهربس الإصابة المشتركة10،11، وكذلك للتجارب الإكلينيكية من مولتيتارجيت ومضادات الميكروبات12، 13 , 14 , 15.
هنا، نحن وصف بروتوكول مفصلة لثقافة explants الأنسجة البشرية التي تم الحصول عليها من اللوزتين والأنسجة المخاطية من انخفاض الأنثى التناسلي (عنق الرحم)، تغطي تشريح الأنسجة explant التحدي مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 بطريقة غير الاستقطاب. ثقافة الأنسجة explants في واجهة الهواء السائل، استخدام الأسفنج الجيلاتين كدعم، يزيد من التعرض للهواء الأكسجين مع توفير إمكانية الوصول إلى المواد الغذائية المتوسطة الثقافة من خلال الأسفنج الشعيرات الدموية، مما أدى إلى تأخير عن الاضمحلال الطبيعي. الطريقة الأكثر مباشرة لتقييم فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ المتماثل في نظامنا لقياس كمية الفيروس أصدرته المناعة أو qPCR في الأجلين المتوسط والثقافة explant على مر الزمن. الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 والمرضية (مثلاً.، استنفاد الخلايا CD4 T) يمكن أيضا تقييم في الأنسجة explants بالجملة استخراج الحمض النووي الريبي/الحمض النووي وقبكر في الموقع تلطيخ أو تحليل خلية واحدة عند الهضم الأنسجة بالتدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الأنسجة البشرية explants لدراسة الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 يوفر مزايا أكثر من مونوتيبيك وثنائي الأبعاد التجريبية النظم التقليدية، مثل الخلايا الأولية أو خطوط الخلايا، سبب قدرتهم الفائقة على استنساخ التفاعلات بين الخلايا و الوظائف الخلوية (مثلاً، إنتاج سيتوكين) كما ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل بمنح من بيلت مؤسسة بلانسيفلور بونكومباني Ludovisi ني (http://blanceflor.se/)، وأطباء المؤسسة السويدية ضد الإيدز (http://www.aidsfond.se/، الرقم FOa2014-0006)، واندريا Fondazione ه لوريني الليبي (http ://fondazionelorini.it/) إلى إينترويني أندريا.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
