Ex Vivoひと免疫不全ウイルス 1 における抗癌剤感受性との人間のリンパ組織と女性の性器粘膜の感染症
Summary
人間組織前のヴィヴォひと免疫不全ウイルス (HIV) の感染は、ウイルスの病因の貴重な 3 D モデルを提供します。ここでは、処理や扁桃腺 HIV – 1 女性生殖器の粘膜からの組織標本に感染し、液体空気インターフェイスで文化でそれらを維持するためのプロトコルについて述べる。
Abstract
Histocultures 許可ひと臓器内の細胞間の相互作用を研究し、彼らは管理された実験室の条件の下でモデル宿主-病原体相互作用を用いることができます。他のウイルスとの間でひと免疫不全ウイルス (HIV) 人間組織の前のヴィヴォの感染症は、有効性と抗ウイルス薬の毒性をテストするためのプラットフォームと同様に、初期の病気の発症を調査する正常に使用されています。この議定書では、処理し HIV 1 組織植扁桃腺と子宮の粘膜から感染し、約 2 週間、液体空気インターフェイスでゼラチン スポンジの上に文化でそれらを維持する方法を説明します。この非偏光のカルチャ設定は、組織の完全性および機能のアーキテクチャの進歩的な損失のまま、主に制限が培養液中の酸素、栄養素へのアクセスを最大化します。このメソッドは、HIV-1 のレプリケーションおよび病因イムノアッセイ、qPCR、フローサイトメトリーなどいくつかの手法を使用して監視できます。重要性、組織ドナー間および、同一体のさまざまな分野から植の生理学的変動実験結果大幅影響可能性があります。結果の再現性を確保する植、技術的複製およびドナーをマッチさせた対照条件の十分な数を使用して、複数の実験からのデータをコンパイルするときに実験的治療の結果を正規化するが重要です (つまり、. 異なるドナーからの組織を使用して行われた、) 統計分析のため。
Introduction
従来、ここと呼ばれる、単型 bi 三次元細胞培養は、多種多様な組織を構成する細胞の種類や臓器間の機能的な空間通信には考慮されません。この側面は、恒常性細胞間相互作用との干渉はすべて病理の運転の要因の病気の実験モデルにとって非常に重要です。組織移植片は、健康と人間の病気をモデリングするため、彼らは1時間の限られた量の生体内で、細胞構築と臓器の多くの重要な機能的側面保持の主要な利点を提供しています。たとえば、ジフテリアや破傷風トキソイドなどのリコール抗原チャレンジ前のヴィヴォに扁桃組織は抗原特異的抗体2の積極的な生産で応答します。他前のヴィヴォのモデルのようなにおける抗癌剤感受性が独自の制限: 間ドナーの可変性、組織偏波、限られた組織生存し、共焦点顕微鏡1の深さ以外のセルの監視の難しさ。それにもかかわらず、人間の組織移植片宿主-病原体相互作用および潜在的な治療上の介在の3を含む人間の恒常性と病原性の免疫学的プロセスを研究する選択のモデルのまま。
HIV 1 病因の重要なイベントは、組織の場所を取る。性器の粘膜の感染症は、すべて HIV 1 伝送イベント世界4の大半を占めています。リンパ組織は急性感染症の中にウイルスの複製の主要なサイトだと潜伏感染細胞5の重要なプールを港湾、その粘り強さは治療6を達成するために主要な障害を表します。人間のリンパ球、粘膜組織の文化と前のヴィヴォの挑戦は、HIV-1 の調査のための隔離されたセルに基づく従来のシステム上のいくつかの利点を提供します。例えば、住民組織細胞は、末梢血単核細胞の1ではなく、外因性の活性化の不在で hiv-1 感染をサポートできます。リンパ組織外植片の使用は急性感染症の認刻極印である cd4 陽性 T 細胞の枯渇、すなわち、傍観者効果7、基になるいくつかの主なメカニズムの理解できました。B 細胞濾胞リンパ組織8と女性性器粘膜外植体9の上皮のような構造の保全では、これらのサイトでの HIV-1 感染の空間と機能の機能を統合するユニークな機会を提供しています。最後に、histocultures 正常に使用されたモデルと HIV とヘルペス ウイルス感染10、11検討、抗レトロ ウイルス薬と多標的殺菌12,の前臨床試験13,14,15。
ここで、非偏光の方法で HIV – 1 のチャレンジを外植体に組織郭清をカバーして扁桃腺と下の女性性器 (子宮頸部) から粘膜組織から得られた人体組織外植片の培養のための詳しいプロトコルを説明します。液体空気インターフェイス、サポートは、ゼラチン スポンジを用いた組織分化の文化は、それ故に自然な腐食、毛細血管を通してスポンジ培地栄養へのアクセスを提供しながら酸素を空気への露出を最大化します。体制における hiv-1 増殖の評価の最も直接的な方法は、免疫または qPCR によって時間をかけて植培にリリースされたウイルスの量を測定することです。HIV-1 感染症と病態 (e.g。、cd4 陽性 T 細胞の枯渇) フローサイトメトリーによる一括 RNA/DNA の抽出によって組織を外植体と qPCR、その場で汚すか、またはティッシュの消化時に単一細胞分析でも評価できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
人間の組織の使用の HIV-1 感染症の研究を提供する初代培養細胞や細胞、細胞間相互作用を再現する優れた性能によりなどの双方向次元と単型従来の実験システム上の利点を外植体と携帯電話は、彼らは体内の、(例えばサイトカイン産生) 機能します。それにもかかわらず、扁桃と頸の組織番号、HIV ターゲット セル1,16の表現型および?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、財団 Blanceflor ボンコンパーニ ルドヴィージ旧姓ビルト (http://blanceflor.se/)、(http://www.aidsfond.se/、ref. FOa2014-0006)、エイズとスタンパーリアラヴェッロ アンドレア e リビ Lorini (http 基礎スウェーデン医師からの補助金によって支えられました。://fondazionelorini.it/) アンドレア ・ Introini に。
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
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