לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture

Summary

דלקת של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) ex-vivo מספק דגם תלת-ממד חשוב של וירוס פתוגנזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לעבד, להדביק דגימות רקמות מן האדם את השקדים mucosae באברי המין הנשי עם HIV-1 ולשמור אותם בתרבות-הממשק נוזלי-אייר.

Abstract

Histocultures אפשר ללמוד אינטראקציות המערכת בתוך רקמות אנושיות, הם יכול להיות מועסק כדי דגם אינטראקציות פתוגן-פונדקאי בתנאי מעבדה מבוקרת. Ex-vivo זיהום של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), בין וירוסים אחרים, שימש בהצלחה לחקור מוקדם בפתוגנזה של המחלה, כמו גם פלטפורמה כדי לבדוק את יעילות ורעילות של תרופות אנטי. בפרוטוקול הנוכחי, נסביר כיצד לעבד, להדביק עם HIV-1 explants רקמת השקדים אנושי, mucosae צוואר הרחם וכן לשמור על אותם בתרבות מעל ג’לטין ספוגים-הממשק נוזלי-אייר למשך שבועיים בערך. הגדרה זו תרבות שאינם מקוטב הגדלת גישה המזינים תרבות בינונית, חמצן, למרות אובדן הדרגתי של רקמות תקינות וארכיטקטורות פונקציונלי נשאר הגבלה הראשי שלה. שיטה זו מאפשרת פיקוח על שכפול HIV-1 ו פתוגנזה בעזרת מספר טכניקות, כולל immunoassays, qPCR של cytometry זרימה. חשיבות, ההשתנות הפיזיולוגיות בין רקמות תורמים, ובין explants מאזורים שונים של הדגימה זהה, עלול להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הניסוי. כדי להבטיח תוצאה הפארמצבטית, זה קריטי להשתמש מספר explants, משכפל טכני והתנאים מתאימים התורם שליטה לנרמל את התוצאות של טיפולים ניסיוניים בעת הידור נתונים ניסויים מרובים (כלומר ., מתנהל באמצעות רקמות מתורמים שונים) לשם ניתוח סטטיסטי.

Introduction

תרביות תאים דו מימדית סוג, התייחס כאן כמו קונבנציונאלי, לא חשבון התקשורת המרחבית ופונקציונליים בין מגוון גדול של סוגי תאים שמרכיבים רקמות ואיברים. היבט זה הוא בחשיבות עליונה עבור גרסאות ניסיוניות של מחלות, כמו הפרעה homeostatic אינטראקציות המערכת היא הגורם המניע של כל פתולוגיות. רקמת explants מציעים יתרונות חשובים עבור מידול בריאות ומחלות בבני כי הם שומרים את cytoarchitecture והיבטים רבים חשוב פונקציונלי של איברים כמו הם ויוו, למרות כמות מוגבלת של זמן¹. לדוגמה, בעת שמחוץ אתגר עם אנטיגנים האחזור, כגון דיפתריה טוקסואידי או טטנוס טוקסואידי, רקמת השקדים מגיב עם הפקה נמרצת של אנטיגן ספציפי נוגדנים². כמו שמחוץ מודל אחר, histoculture יש מגבלות משלו: התורם בין השתנות, קיטוב רקמות, רקמות מוגבל הישרדות, הקושי ניטור תאי מעבר עומק מיקרוסקופיה קונפוקלית¹. למרות זאת, רקמה אנושית explants נשארים מודל של הבחירה ללמוד תהליכים אימונולוגי homeostatic פתוגניים בבני אדם, כולל אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, התערבויות טיפוליות אפשריות³.

האירועים הקריטיים של פתוגנזה HIV-1 מתקיימים ברקמות. דלקת של רירית איברי המין חשבונות עבור הרוב המכריע של כל HIV-1 שידור אירועים ברחבי העולם⁴. רקמות הלימפה נמצא האתר העיקרי של וירוס שכפול במהלך זיהום אקוטי בנמלים מאגר משמעותי של תאים הנגועים לחשוף⁵ו ההתמדה שלהם מייצג את המכשול העיקרי להשגת התרופה⁶. האתגר תרבות, ex-vivo של רקמות הלימפה ואת הרירית לספק כמה יתרונות לעומת מערכות קונבנציונאלי המבוסס על תאים מבודדים עבור המחקר של HIV-1. למשל, שוכנת רקמת תאים יכול לתמוך זיהום ב- HIV-1 בהיעדרו של הפעלה אקסוגני, לעומת תאי תאי דם היקפיים¹. השימוש של רקמת הלימפה explants אפשרה הבנה טובה יותר של כמה מנגנונים מרכזיים שבבסיס CD4 T תא דלדולכלומר, אפקט הצופה מהצד⁷, וזה סימן ההיכר של דלקת חריפה. שימור מבנים כמו תא B זקיקי הלימפה ברקמות⁸ ו האפיתל רירית איברי המין הנשי explants⁹ מציע הזדמנות ייחודית לשלב תכונות המרחבי פונקציונלי של זיהום ב- HIV-1 באתרים אלה. לבסוף, histocultures שימשו בהצלחה מודל המחקר HIV-1 וההרפס ושיתוף הידבקות^10,11, כמו גם לניסויים פרה של antiretrovirals ו multitarget microbicides^{12, 13 , 14 , 15}.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור התרבות של רקמה אנושית explants המתקבל השקדים ורקמות הרירית מ נמוך יותר בדרכי המין הנשי (צוואר הרחם), כיסוי לנתיחה רקמות כדי explant אתגר עם HIV-1 בדרך הלא מקוטב. התרבות של רקמת explants-הממשק אוויר נוזלי, בעזרת ג’לטין ספוגים כמשענת, הגדלת החשיפה מהאוויר חמצן תוך מתן גישה תרבות בינוני חומרים מזינים באמצעות הספוג נימים, ובכך לעכב את הריקבון הטבעי שלהם. הדרך המיידית ביותר להערכת שכפול HIV-1 במערכת שלנו היא למדוד את כמות וירוס שפורסם המדיום תרבות explant לאורך זמן על-ידי מתכלה או qPCR. זיהום ב- HIV-1, פתוגנזה (למשל., דלדול תאי CD4 T) גם ניתן להעריך רקמת explants על-ידי בצובר מיצוי RNA/DNA ו- qPCR, בחיי עיר מכתים או תא בודד-אנליזה על עיכול רקמת מאת cytometry זרימה.

Protocol

הפרוטוקול עבור אוסף של רקמות עשויים לדרוש אישור מוסרי על ידי הרשויות המוסמכות מקומיים. במקרה של ניתוחים המצוין כגון ניתוח שקדים, כריתת רחם, הדגימות לא שנאספו במיוחד לצורך המחקר, המחקר אינו נחשב ניסויים מחקר (המכון הלאומי לבריאות. מחקר בנושאים האנושית. https://humansubjects.nih.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11). ?…

Representative Results

ניתן להשתמש במספר טכניקות כדי להעריך את שכפול HIV-1 ברקמות explants. Read-out הסטנדרטי שלנו היא למדוד את כמות HIV-1 p24מחסום פה שיצא בס מ לאורך זמן עם מתכלה18. רקמת explants מתורמים שונים, נגוע את inoculum באותה המניה HIV-1 זהה, תניב כמויות שונות ?…

Discussion

השימוש של רקמה אנושית explants עבור המחקר להידבקות ב- HIV-1 מספק יתרונות על פני המסורתית דו מימדית סוג ניסיוני ומערכות, כגון ראשי תאים או שורות תאים, בשל יכולתם מעולה לשחזור המערכת אינטראקציות ו סלולרי מתפקד (למשל, ייצור ציטוקינים) כפי שהם ויוו. למרות זאת, רקמת השקדים ואת צוואר הרחם שוני?…

Materials

Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge	Pfizer	NDC:  0009-0315-08	Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge	Ferrosan Medical Devices	MS0002	Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamine	ThermoFisher Scientific	21875034	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)	ThermoFisher Scientific	11140035	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x)	ThermoFisher Scientific	11360070	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x)	ThermoFisher Scientific	15750037	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x)	ThermoFisher Scientific	15290018	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS)			To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanate	Sigma-Aldrich	33454-100MG	Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red			To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL	NIH AIDS Reagent Program	510	The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04	NIH AIDS Reagent Program	2522	The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC)	NIH AIDS Reagent Program	8146	Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm