मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) के साथ मानव ऊतकों के संक्रमण पूर्व vivo वायरस रोगजनन का एक मूल्यवान 3d मॉडल प्रदान करता है । यहां, हम प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और मानव tonsils और एचआईवी के साथ मादा जननांग म्यूकोसा से ऊतक नमूनों को संक्रमित-1 और उंहें संस्कृति में बनाए रखने के तरल हवा अंतरफलक पर ।
Histocultures मानव ऊतकों के भीतर परस्पर संपर्क का अध्ययन करने की अनुमति है, और वे मॉडल मेजबान को नियोजित किया जा सकता है नियंत्रित प्रयोगशाला शर्तों के तहत रोगज़नक़ बातचीत । मानव इम्यूनो वायरस के साथ मानव ऊतकों के पूर्व vivo संक्रमण (एचआईवी), अन्य वायरस के बीच, सफलतापूर्वक प्रारंभिक रोग रोगजनन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, साथ ही एंटीवायरल दवाओं की प्रभावकारिता और विषाक्तता का परीक्षण करने के लिए एक मंच. वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम कैसे प्रक्रिया और एचआईवी के साथ संक्रमित-1 मानव tonsils और गर्भाशय की श्लेष्मा झिल्ली से explants ऊतक, और उंहें के बारे में दो सप्ताह के लिए तरल हवा अंतरफलक पर जिलेटिन स्पंज के शीर्ष पर संस्कृति में बनाए रखने की व्याख्या । यह गैर-ध्रुवीकरण संस्कृति की स्थापना संस्कृति मध्यम और ऑक्सीजन में पोषक तत्वों तक पहुंच को अधिकतम, हालांकि ऊतक अखंडता और कार्यात्मक वास्तुकला के प्रगतिशील नुकसान इसकी मुख्य सीमा बनी हुई है । इस विधि एचआईवी-1 प्रतिकृति और immunoassays, qPCR, और प्रवाह cytometry सहित कई तकनीकों, का उपयोग कर रोगजनन की निगरानी की अनुमति देता है । महत्व के, ऊतक दाताओं के बीच शारीरिक परिवर्तनशीलता, के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक ही नमूना के विभिंन क्षेत्रों से explants के बीच, काफी प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । परिणाम reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, यह explants की एक पर्याप्त संख्या का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, तकनीकी प्रतिकृति, और दाता-मिलान नियंत्रण शर्तों प्रयोगात्मक उपचार के परिणामों को सामान्य करने के लिए जब कई प्रयोगों से डेटा संकलन (यानी ., विभिंन दाताओं से ऊतक का उपयोग कर आयोजित) सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ।
Monotypic द्वि-आयामी सेल संस्कृतियों, यहां पारंपरिक रूप में संदर्भित, कोशिका प्रकार की बड़ी विविधता है कि ऊतकों और अंगों की रचना के बीच स्थानिक और कार्यात्मक संचार के लिए खाते में नहीं है । इस पहलू रोग के प्रयोगात्मक मॉडल के लिए सर्वोपरि महत्व का है, समस्थिति सेलुलर बातचीत के साथ हस्तक्षेप के रूप में सभी विकृतियों के ड्राइविंग कारक है । ऊतक explants मानव में मॉडलिंग स्वास्थ्य और रोग के लिए प्रमुख लाभ प्रदान करते हैं क्योंकि वे cytoarchitecture और अंगों के कई महत्वपूर्ण कार्यात्मक पहलुओं को बनाए रखने के रूप में वे vivo मेंहैं, हालांकि समय की एक सीमित राशि के लिए1. उदाहरण के लिए, जैसे डिप्थीरिया टोक्शहॉइड या टिटनेस टोक्शहॉइड के रूप में याद प्रतिजनों के साथ पूर्व vivo चैलेंज पर, tonsillar ऊतक प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी2का एक जोरदार उत्पादन के साथ प्रतिक्रिया करता है । किसी भी अंय पूर्व vivo मॉडल की तरह, histoculture अपनी सीमाओं: अंतर दाता परिवर्तनशीलता, ऊतक ध्रुवीकरण, सीमित ऊतक अस्तित्व, और फोकल माइक्रोस्कोपी1की गहराई से परे कोशिकाओं की निगरानी में कठिनाई है । फिर भी, मानव ऊतक explants की पसंद का एक मॉडल रहने के लिए समस्थिति और मानव में रोगजनक प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं का अध्ययन, सहित मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत और संभावित चिकित्सकीय हस्तक्षेप3।
एचआईवी-1 रोगजनन की महत्वपूर्ण घटनाओं के ऊतकों में जगह ले । सभी एचआईवी के बहुमत के लिए जननांग म्यूकोसा खातों के संक्रमण-1 दुनिया भर में संचरण की घटनाओं4. लसीकावत् ऊतक तीव्र संक्रमण के दौरान वायरस प्रतिकृति के प्रमुख स्थल है और अव्यक्त-संक्रमित5कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण पूल बंदरगाह, और उनके हठ मुख्य बाधा एक इलाज6को प्राप्त करने के लिए प्रतिनिधित्व करता है । संस्कृति और मानव लसीकावत् और श्लैष्मिक के ऊतकों के पूर्व vivo चैलेंज एचआईवी के अध्ययन के लिए अलग कोशिकाओं के आधार पर पारंपरिक प्रणालियों पर कुछ लाभ-1 प्रदान करते हैं । उदाहरण के लिए, ऊतक निवासी कोशिकाओं exogenous सक्रियण के अभाव में एचआईवी-1 संक्रमण का समर्थन कर सकते हैं, के रूप में परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं1का विरोध किया । लसीकावत् ऊतक explants के उपयोग के कुछ प्रमुख CD4 टी सेल कमी, यानीअंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ की अनुमति दी है, गैरा प्रभाव7, जो तीव्र संक्रमण की पहचान है । लसीकावत् ऊतक में बी कोशिका कूप की तरह संरचनाओं के संरक्षण8 और मादा जननांग म्यूकोसा explants9 में उपकला इन साइटों पर एचआईवी-1 संक्रमण के स्थानिक और कार्यात्मक सुविधाओं को एकीकृत करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. अंत में, histocultures सफलतापूर्वक मॉडल और अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया एचआईवी-1 और herpesvirus सह संक्रमण10,11, के रूप में अच्छी तरह के रूप में antiretrovirals और multitarget माइक्रोबाइसाइडों12के पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए, 13 , 14 , 15.
यहां, हम मानव ऊतक explants की संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन कम मादा जननांग पथ (गर्भाशय ग्रीवा) से tonsils और श्लैष्मिक ऊतक से प्राप्त की, एक गैर में explant चुनौती के लिए ऊतक विच्छेदन-1 से कवर-एक तरह से ध्रुवीकरण । तरल हवा अंतरफलक पर ऊतक explants की संस्कृति, एक समर्थन के रूप में जिलेटिन स्पंज का उपयोग, वायु ऑक्सीजन के लिए जोखिम को अधिकतम जबकि स्पंज केशिकाओं के माध्यम से संस्कृति मध्यम पोषक तत्वों तक पहुंच प्रदान करने, इस प्रकार उनके प्राकृतिक क्षय में देरी । हमारे सिस्टम में एचआईवी-1 प्रतिकृति के मूल्यांकन का सबसे तत्काल तरीका immunoassay या qPCR द्वारा समय के साथ explant संस्कृति माध्यम में जारी वायरस की मात्रा को मापने के लिए है । एचआईवी-1 संक्रमण और रोगजनन (जैसे, CD4 टी सेल कमी) भी थोक आरएनए द्वारा ऊतक explants में मूल्यांकन किया जा सकता/डीएनए निष्कर्षण और qPCR, में सीटू धुंधला, या एक सेल-विश्लेषण द्वारा ऊतक पाचन पर प्रवाह cytometry.
एचआईवी के अध्ययन के लिए मानव ऊतक explants के उपयोग-1 संक्रमण पारंपरिक द्वि-आयामी और monotypic प्रयोगात्मक प्रणालियों, प्राथमिक कोशिकाओं या सेल लाइनों के रूप में लाभ प्रदान करता है, उनके बेहतर सेलुलर बातचीत को पुन: …
The authors have nothing to disclose.
यह काम फाउंडेशन Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), एड्स के खिलाफ फाउंडेशन स्वीडिश चिकित्सकों (http://www.aidsfond.se/, रेफरी. FOa2014-0006), और Fondazione Andrea ई लिबी Lorini (http से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ://fondazionelorini.it/) to Andrea Introini.
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
Sterile cell culture grade water | |||
Sterile transportation container | |||
70% ethanol solution | |||
Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
Sterile metal forceps or tweezers | |||
Sterile metal scissors | |||
Sterile flat weighing metal spatula | |||
Sterile scalpels and blades | |||
6-well cell culture plates | |||
12-well cell culture plates | |||
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
Biological safety cabinet | |||
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
Water bath set at 37 °C | |||
Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |