Ex Vivo Infektion av mänskliga lymfoida vävnad och kvinnliga genitala slemhinnan med humant immunbristvirus 1 och Histoculture
Summary
Infektion av mänskliga vävnader med humant immunbristvirus (HIV) ex vivo ger en värdefull 3D modell av virus patogenes. Här beskriver vi ett protokoll för att bearbeta och infektera vävnadsprover från mänskliga tonsiller och kvinnliga genitala slemhinnor med HIV-1 och underhålla dem kultur i gränssnittet vätska-luft.
Abstract
Histocultures att studera intercellulära interaktioner inom mänskliga vävnader, och de kan användas till modell värd-patogen interaktioner under kontrollerade laboratorieförhållanden. Ex vivo infektion av mänskliga vävnader med humant immunbristvirus (HIV), bland andra virus, har använts framgångsrikt att undersöka tidiga sjukdomspatogenes, samt en plattform för att testa effekt och toxicitet av antivirala läkemedel. I detta protokoll förklarar vi hur du bearbetar och infektera med HIV-1 vävnad bladsticklingar från mänskliga tonsiller och cervikal slemhinnor, och upprätthålla dem i kultur ovanpå Gelatinsvampar på gränssnittet vätska-luft för ungefär två veckor. Inställningen icke-polariserat kultur maximerar tillgång till näring i odlingsmedium och syre, även om progressiv förlust av vävnad integritet och funktionella arkitekturer förblir dess huvudsakliga begränsning. Denna metod tillåter övervakning av HIV-1 replikering och patogenes med hjälp av flera tekniker, inklusive immunanalyser, qPCR och flödescytometri. Av betydelse, kan fysiologiska variabiliteten mellan vävnad givare samt mellan bladsticklingar från olika delar av samma prov, avsevärt påverka experimentella resultat. För att säkerställa resultatet reproducerbarhet, är det viktigt att använda ett tillräckligt antal bladsticklingar, tekniska replikat och givare-matchade kontroll villkor för att normalisera resultaten av de experimentella behandlingarna när sammanställa data från flera experiment (dvs ., genomförda använda vävnad från olika givare) för statistisk analys.
Introduction
Monotypiskt bi-dimensionell cellkulturer, här avses som konventionella, ska inte redogöra för den rumsliga och funktionella kommunikationen mellan den stora mängden celltyper som komponera vävnader och organ. Denna aspekt är av avgörande betydelse för experimentella modeller av sjukdom, störningar med homeostatiska intercellulära interaktioner är den drivande faktorn av alla patologier. Vävnaden bladsticklingar erbjuder stora fördelar för modellering hälsa och sjukdom hos människor eftersom de behåller cytoarchitecture och många viktiga funktionella aspekter av organ som de är i vivo, men för en begränsad mängd tid1. Exempelvis vid ex vivo utmaning med recall antigener, såsom difteritoxoid eller tetanustoxoid, svarar tonsillar vävnad med en kraftig produktion av antigen-specifika antikroppar2. Som någon annan ex vivo modell, histoculture har sina egna begränsningar: mellan givare variabilitet, vävnad polarisering, begränsad vävnad överlevnad och svårigheter att övervaka celler utöver djupet av konfokalmikroskopi1. Mänsklig vävnad bladsticklingar är ändå en modell av val att studera homeostatiska och patogena immunologiska processer hos människor, inklusive värd-patogen interaktioner och potentiella terapeutiska interventioner3.
HIV-1 patogenes kritiska händelser äga rum i vävnader. Infektion av genitalslemhinnan räkenskaperna för majoriteten av alla HIV-1 överföring händelser i världen4. Lymfatisk vävnad är stora platsen för virusreplikation under akut infektion och hamnar en stor pool av latent infekterade celler5och persistens representerar det främsta hindret för uppnå en bota6. Kultur och ex vivo utmaningen av mänskliga lymfoida och slemhinnor vävnader ger vissa fördelar gentemot konventionella system baserat på isolerade celler för studier av HIV-1. Vävnad-bosatt celler kan stöder exempelvis HIV-1 infektion i avsaknad av exogena aktivering, i motsats till perifera mononukleära blodceller1. Användning av lymfoid vävnad bladsticklingar har möjliggjort en bättre förståelse för vissa viktiga mekanismerna bakom CD4 T cell utarmningdet vill säga, den åskådare effekt7, vilket är kännetecknande för akut infektion. Bevarandet av strukturer som B-cell folliklar i lymfoid vävnad8 och epitelet i kvinnliga genitalslemhinna bladsticklingar9 erbjuder en unik möjlighet att integrera rumsliga och funktionella funktioner för HIV-1 infektion vid dessa platser. Slutligen, histocultures användes framgångsrikt till modell och studie HIV-1 och herpesvirus samtidig infektion10,11, liksom för preklinisk testning av antiretrovirala och multitarget mikrobicider12, 13 , 14 , 15.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för kulturen i mänsklig vävnad bladsticklingar erhållits från tonsiller och slemhinnor vävnad från lägre kvinnliga könsorganen (livmoderhals), som omfattar vävnad dissektion för att explant utmaning med HIV-1 i ett icke-polariserat sätt. Kulturen av vävnad bladsticklingar på det flytande-luft-gränssnittet med Gelatinsvampar som ett stöd, maximerar exponeringen för att luften syre samtidigt som den ger tillgång till odlingsmediet näringsämnen genom svampen kapillärer, därmed fördröja deras naturliga förfall. Det mest direkta sättet att utvärdera HIV-1 replikering i vårt system är att mäta mängden virus släppt explant odlingssubstratet över tid av immunoassay eller qPCR. HIV-1-infektion och patogenes (t.ex., CD4 T cell utarmning) kan också utvärderas i vävnad bladsticklingar av bulk RNA/DNA-extraktion och qPCR, i situ färgning eller enda cell-analys vid vävnad matsmältningen av flödescytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användning av mänsklig vävnad explants för studier av HIV-1 infektion ger fördelar jämfört med traditionella bi-dimensionell och monotypiskt experimentella system, såsom primära celler eller cellinjer, på grund av sin överlägsna förmåga att återge intercellulära interaktioner och cellulära funktioner (t.ex., cytokin produktion) som de är i vivo. Dock tonsillar och cervikal vävnad skiljer sig i många aspekter, inklusive numret och fenotypiska och funktionella egenskaper HIV mål celle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från den stiftelsen Blanceflor Boncompagni-Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), Stiftelsen Svenska läkare mot AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006), och Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) till Andrea Introini.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
