Vi har manipuleret kapsid proteiner af hepatitis E virus som en theranostic nanopartikel (HEVNP). HEVNP samler selv i en stabil ikosaedriske bur i slimhinden levering. Her beskriver vi ændring af HEVNPs for tumor målretning af muterer overflade-eksponerede rester til cysteines, som konjugat syntetiske ligander, der specifikt binder tumorceller.
Viruslignende partikler (VLPs) har været brugt som nanocarriers til at vise udenlandske epitoper og/eller levere små molekyler i detektion og behandling af forskellige sygdomme. Dette program er baseret på genetisk modifikation, samlesæt, og cystein konjugation at opfylde tumor-targeting anvendelsen af rekombinante VLPs. sammenlignet med genetiske modifikation alene, kemiske konjugation af udenlandske peptider til VLPs tilbyder en væsentlig fordel fordi det giver mulighed for en række forskellige enheder, såsom syntetiske peptider eller oligosaccharider, at være konjugeret til overfladen af VLPs i en differentieret og fleksibel måde uden ændring af VLP forsamling.
Her, viser vi hvordan man bruger hepatitis E virus nanopartikel (HEVNP), et modulopbygget theranostic kapsel, som multifunktionelle levering transportør. Funktioner af HEVNPs omfatter målretning af væv, billedbehandling og terapeutiske levering. Baseret på veletablerede strukturelle forskning af HEVNP, blev strukturelt uafhængig og overflade-eksponerede rester udvalgt til cystein udskiftning som konjugation websteder for maleimide i forbindelse med kemiske grupper via thiol-selektiv forbindelser. En bestemt cystein-modificeret HEVNP (Cys udskiftning af asparagin på 573 aa (HEVNP – 573C)) blev konjugeret med et bryst kræft celle-specifikke ligand, LXY30 og mærket med nær-infrarødt (NIR) Fluorescens dye (Cy5.5), gengivelse af tumor-målrettet HEVNPs som effektivt diagnostiske kapsler (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Lignende engineering strategier kan være ansat med andre makromolekylære komplekser med velkendte atomic strukturer til at udforske potentielle anvendelser i theranostic levering.
Udvikling af nano-størrelse vektorer i terapeutiske og diagnostiske levering, kendt som nanotheranostics, har flyttet meget af den biomedicinske felt fra generaliseret behandlinger mod målrettet levering1. Målrettede nanotheranostic levering integrerer nano-størrelse vektorer (nanopartikler) med theranostic molekyler til stabilt direkte theranostic molekyler til en specifik sygt væv eller biokemisk pathway2,3,4 . Nanomedicin er kommet i forgrunden af målrettet levering fordi optimalt mellemstore nanopartikler har kapacitet til at stabilisere cirkulation af theranostic molekyler og selektivt målrette cellens overflade molekyler præsenteret på syge væv. Mange nanotheranostic platforme stadig lider af passive celle optagelse, pre-moden nedbrydning, toksicitet og utilstrækkelig association med theranostic molekyler. VLPs overvinde mange af disse hindringer i målrettet levering. De har været brugt som nanocarriers til at vise udenlandske epitoper og/eller levere små molekyler: et regime, der kan bruges til at bekæmpe mange sygdomme1. Dette program bygger primært på egenskaben i samlesæt og lethed af genetiske modifikationer, at opfylde programmet designet til den givne VLP. Sammenlignet med genteknologi, kemiske konjugation af udenlandske peptider til VLP viser en betydelig fordel, fordi det giver mulighed for en lang række enheder, såsom peptider eller oligosaccharider, at være konjugeret til overfladen af VLPs i en moduleret og fleksibel måde uden ændring af VLP forsamling.
HEVNPs, afledt af af rekombinante HEV kapsid proteiner, 2nd åben læsning frame (ORF2), er ikke-infektiøse, selv samle capsids i stand til celle-bindende og post. Fordi HEV udviklet sig til slimhinden transmission, er forsamlede kapsid proteiner ligeledes stabil i proteolytiske og sure slimhinde betingelser5. HEVNPs danner en hule, T = 1 ikosaedriske kapsid, der består af 60 identiske enheder6,7 i ORF2, gør det yderst stabil i opbevaring og barske fysiologiske forhold. Mangler enhver viral genetiske elementer, er effektive og højt udbytte produktion opnået gennem baculovirus ekspressionssystem i insekt celler. På grund af deres proteolytiske stabilitet, er selvsamlede HEVNPs udvindes og renset fra celle supernatanten, betydeligt reducere nødvendige rensning trin. Derudover besidder HEVNPs en overflade udsat fremspring domæne (P domæne) tilsluttet via en fleksibel hængsel til en stabil ikosaedriske base. Domænet P danner overfladen-eksponerede pigge på toppen af den ikosaedriske base mens den fleksibel hængsel gør det muligt at væsentligt ændre domænet P uden at kompromittere den base ikosaedriske struktur. Med 60 gentagne enheder, enkelt lokationsspecifikke ændring resulterer i 60 symmetrisk websteder for kemiske graduering. For nylig har vi foreslået en nano-platform ved hjælp af HEVNP, der kan kemisk konjugat ligander eller små molekyler til theranostic applikationer. Dette blev opnået ved at udskifte en enkelt aminosyre med cystein på domænet fremspring af HEV-VLP som en reaktion site med maleimide-linked peptider eller molekyler. Baseret på tidligere strukturel analyse af HEV-VLP og velundersøgte immunogen epitoper8,9, de følgende fem HEV-VLP aminosyrer blev erstattet med cystein som potentielle kandidater: Y485C, T489C, S533C, N573C og T586C ( Figur 1). Efter proteinekspression og -oprensning fra insekt celler, deres VLP formationer blev bekræftet af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) observation (figur 2), og de udsatte cystein websteder blev analyseret af Western duppes efter maleimide-linked biotin konjugering (figur 2). Blandt de fem mutanter, HEVNP – 573C vises det stærkeste signal om maleimide-biotin konjugering (figur 2) og blev brugt til opfølgning demonstration som nanocarrier for bryst kræftcelle målretning4 (figur 3).
Denne protokol skildrer kemiske konjugation metoder for at tillægge HEVNPs tumor-targeting molekyler gennem overfladen cystein konjugering. Vi detalje konjugation af tumor målretning og sporing molekyler til tumor levering med rekombinante HEVNPs indeholdende en cysteine på N573 (HEVNP – 573C). Vi fokuserede på en to-trins Klik kemi konjugation proces til at binde en bryst kræft tumor målretning peptid, LXY3010 til HEVNPs form LXY30-HEVNP (figur 4). Efterfølgende, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 blev konjugeret til separat Lys-webstedet på HEVNPs at bygge LXY30-HEVNP-Cy5.5 til registrering af fluorescerende både in vitro- (figur 5) og in vivo4.
I modsætning til den tidskrævende genteknologi procedure, som normalt tager uger, her vi demonstrere simpel totrins og one-step kemiske konjugation procedurer, som kan være afsluttet inden for 3 dage, for at tilføje kræft målretning ligand og/eller Fluorescens påvisning farvestof til Cys/Lys steder i HEVNPs. Teknikken kan bruges til at screene for bedste ligand målet fra en pulje af ansøgere, og dermed tager fordel af de tilgængelige peptid/lille molekyle syntese tjenester til en rimelig pris og levering tid.</…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender sponsorering af finansieringen til RHC af NIH yde #’ s: AI095382, EB021230, CA198880, Statens Institut for fødevarer og landbrug samt Finland Distinguished Professor program.
MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |