Overflate Functionalization av hepatitt E Virus nanopartikler bruke kjemiske Bøyning
Summary
Vi har konstruert kapsid protein av hepatitt E som en theranostic hydrogenion (HEVNP). HEVNP samler selv i en stabil icosahedral bur mucosal levering. Her beskriver vi endring av HEVNPs for svulst målretting etter mutere overflaten-eksponerte rester til cysteinene, hvilke bøy syntetiske ligander som spesifikt binder kreftceller.
Abstract
Virus-lignende partikler (VLPs) har blitt brukt som nanocarriers å vise utenlandske epitoper og/eller levere små molekyler i gjenkjenning og behandling av ulike sykdommer. Dette programmet bruker genetisk modifisering, selvstendig montering og cystein Bøyning å oppfylle svulst målretting anvendelse av rekombinant VLPs. sammenlignet med genetisk modifisering alene, kjemiske Bøyning av utenlandske peptider å VLPs tilbyr en betydelig fordel fordi det gir en rekke enheter, for eksempel syntetiske peptider eller oligosaccharides, å bli bøyd på overflaten av VLPs på en modulated og fleksibel måte uten endring av samlingen VLP.
Her viser vi hvordan du bruker hepatitt E virus hydrogenion (HEVNP), en modularized theranostic kapsel, som en multifunksjonell levering bærer. Funksjoner av HEVNPs inkluderer vev målretting, bildebehandling og terapeutiske levering. Basert på veletablerte strukturelle arbeidet til HEVNP, ble strukturelt uavhengig og overflaten-eksponerte rester valgt for cystein erstatning som Bøyning områder for maleimide-tilknyttet kjemiske grupper via thiol-selektiv sammenhengene. Ett bestemt cystein modifisert HEVNP (en Cys utskifting av asparagine på 573 aa (HEVNP – 573C)) var konjugert til en bryst kreft celle-spesifikke ligand, LXY30 og merket med nær infrarød (NIR) fluorescens fargestoff (Cy5.5), gjengivelse av svulst målrettede HEVNPs som effektive diagnostiske kapsler (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Lignende engineering strategier kan brukes med andre macromolecular komplekser med kjente atomic strukturer å utforske bruksmuligheter theranostic levering.
Introduction
Utviklingen av nano-størrelse vektorer i terapeutiske og diagnostiske levering, kjent som nanotheranostics, har flyttet mye av biomedisinsk feltet fra generalisert behandlinger til målrettet levering1. Målrettet nanotheranostic levering integrerer nano-størrelse vektorer (nanopartikler) med theranostic molekyler til stabilt direkte theranostic molekyler til en bestemt syke vev eller biokjemiske sti2,3,4 . Nanomedicine har kommet i forkant av målrettet levering fordi optimalt størrelse nanopartikler har kapasitet til å stabilisere sirkulasjon av theranostic molekyler og selektivt målet cellen overflaten molekyler på sykt vev. Mange nanotheranostic plattformer er fortsatt lider av passiv celle opptak, tidlig fornedrelse, giftighet og tilstrekkelig tilknytning theranostic molekyler. VLPs overvinne mange av disse hindringene i målrettede levering. De har blitt brukt som nanocarriers å vise utenlandske epitoper og/eller levere små molekyler: en diett som kan brukes til å bekjempe mange sykdommer1. Dette programmet bruker hovedsakelig for selv-montering og enkel genetiske modifikasjoner, å oppfylle utformede programmet for den gitte VLP. Sammenlignet med genetisk engineering, kjemiske Bøyning av utenlandske peptider å VLP viser en betydelig fordel fordi det tillater et stort utvalg av enheter, for eksempel peptider eller oligosaccharides, å bli bøyd på overflaten av VLPs i en modulated og fleksibel måte uten endring av VLP montering.
HEVNPs, avledet fra rekombinant HEV kapsid protein, 2nd åpne lesing frame (ORF2), er ikke-smittsomme, selv montering capsids celle-binding og oppføring. HEV utviklet for mucosal overføring, er samlet kapsid protein tilsvarende stabil i proteolytisk og sure mucosal forhold5. HEVNPs danner en hul, T = 1 icosahedral kapsid, består av 60 identiske enheter6,7 i ORF2, gjengi det svært stabile både i lagring og harde fysiologiske forhold. Mangler noen viral genetiske elementer, er effektiv, høy avkastning produksjon oppnådd gjennom baculovirus uttrykk i insekt celler. På grunn av deres proteolytisk stabilitet, er selv montert HEVNPs utdraget og renset fra cellen nedbryting, vesentlig reduserer nødvendige rensing trinnene. HEVNPs har i tillegg en overflate eksponert protrusion domene (P domene) via et fleksibelt hengsel til en stabil icosahedral base. P domenet danner overflaten-eksponerte toppene på icosahedral base mens fleksibel hengslene gjør det mulig å betydelig endre P domenet uten at base icosahedral strukturen. Med 60 gjentatte enheter, enkelt områdespesifikke endring resulterer i 60 symmetrisk nettsteder for kjemiske modulering. Nylig vi foreslått en nano-plattform med HEVNP som kan kjemisk bøy ligander eller små molekyler for theranostic programmer. Dette ble oppnådd ved å erstatte en enkelt aminosyre med cystein protrusion domenet av HEV-VLP som en reaksjon med maleimide-tilknyttet peptider eller molekyler. Basert på tidligere strukturelle analyser av HEV-VLP og godt studert immunogenic epitopes8,9, følgende fem HEV-VLP aminosyrer ble erstattet med cystein som potensielle kandidater: Y485C, T489C, S533C, N573C og T586C ( Figur 1). Etter uttrykk og rensing fra insekt celler, deres VLP formasjoner ble bekreftet av overføring elektronmikroskop (TEM) observasjon (figur 2), og utsatte cystein områdene ble analysert Western blot etter maleimide-tilknyttet biotin Bøyning (figur 2). Blant fem mutanter, HEVNP – 573C vises det sterkeste signalet til maleimide-biotin Bøyning (figur 2) og ble brukt for oppfølging demonstrasjon som nanocarrier for bryst kreftcelle målretting4 (Figur 3).
Denne protokollen viser kjemiske Bøyning metoder for å knytte svulst målretting molekyler til HEVNPs gjennom overflaten cystein Bøyning. Vi detalj Bøyning av svulst målretting og oppdagelsen molekyler for svulst levering med rekombinant HEVNPs som inneholder en cystein på N573 (HEVNP – 573C). Vi fokusert på en klikk kjemi Bøyning prosess å binde en bryst kreft svulst målretting peptid, LXY3010 til HEVNPs form LXY30-HEVNP (Figur 4). Deretter N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 var konjugert til eget Lys-området på HEVNPs å bygge LXY30-HEVNP-Cy5.5 for fluorescerende oppdagelsen både i vitro (figur 5) og i vivo4.
Protocol
Representative Results
Discussion
I motsetning til tidkrevende genteknologi prosedyren, som vanligvis tar uker, her vi viser enkel totrinns og ettrinns kjemiske Bøyning prosedyrer, som kan fullføres innen 3 dager, å legge kreft målretting ligand og/eller fluorescens oppdagelsen fargestoff til Cys/Lys nettstedene til HEVNPs. Teknikken kan brukes til skjermen for beste ligand mål fra en pool av kandidater, og dermed drar nytte av tilgjengelige peptid/små molekyl syntese tjenester til en rimelig pris og leveringstider tid.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne bekrefter sponsing av midler til RHC ved NIH gi #’ s: AI095382, EB021230, CA198880, National Institute of mat og landbruk, i tillegg til Finland Distinguished Professor programmet.
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
- Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
- Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
- Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
- Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
- Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
- Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
- Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
- Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
- Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
- Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
- Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
- Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
- Technologies, N. b. L. . Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).
- Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).
