Menneskelige telomerase reverse transkriptase (TERT) syntetiserer ikke kun telomeric DNA, men også dobbelt-strenget RNA gennem RNA-afhængige RNA polymerase aktivitet. Her beskriver vi et nyetableret assay til påvisning af RNA-afhængige RNA polymerase aktivitet af endogene TERT.
Menneskelige telomerase reverse transkriptase (TERT) er den katalytiske underenhed af telomerase, og det elongates telomere gennem RNA-afhængige DNA polymerase aktivitet. Selvom TERT er navngivet som en reverse transkriptase, demonstrere strukturelle og Fylogenetisk analyse af TERT at TERT er medlem af højrehåndet polymeraser, og vedrører viral RNA-afhængige RNA polymeraser (RdRPs) samt viral reverse transkriptase. For det første identificerede vi RdRP aktiviteten af menneskelige TERT, der genererer komplementære RNA står til en skabelon ikke-kodende RNA og bidrager til RNA silencing i kræftceller. For at analysere denne ikke-kanoniske enzymatisk aktivitet, vi udviklet RdRP assay med rekombinant TERT i 2009, derefter etableret i vitro RdRP analyse for endogene TERT. I dette manuskript beskriver vi sidstnævnte metode. Kort, TERT immunkomplekser er isoleret fra celler, og inkuberes med skabelon RNA og rNTPs herunder radioaktive rNTP for RdRP reaktion. For at eliminere enkeltstrenget RNA, behandles reaktionsprodukter med RNase jeg, og de endelige produkter analyseres med polyacrylamid gelelektroforese. Radiolabeled RdRP produkter kan påvises ved Autoradiografi efter natten eksponering.
Menneskelige telomerase reverse transkriptase (TERT) er kendt som den katalytiske underenhed af telomerase, og det elongates telomere ved hjælp af telomerase RNA komponent (TERC), de specifikke RNA skabelon1. Selv om TERT polymeriserer telomeric DNA som en del af telomerase, viser de strukturelle og fylogenetiske analyser at TERT hænger nøje sammen med viral RNA-afhængige RNA polymeraser (RdRPs) samt viral reverse transkriptase og deler domæner med disse polymeraser2,3,4. RdRP er det enzym, der genererer komplementære RNA strand til en skabelon RNA. Enzymet er kodet ikke kun i virus, men også i modelorganismer såsom planter, gær og orm, og dobbelt-strenget RNA syntese af RdRP bidrager til transcriptional og post-transcriptional genhæmning i disse organismer5,6 . Selv om menneskelige RdRP havde manglet længe, fandt vi RdRP aktivitet i menneskelige TERT i 20097.
Vi først bekræftet RdRP aktivitet af TERT med rekombinant protein7, så etableret en følsomme i vitro assay til påvisning af RdRP aktivitet af endogene TERT8. Her viser vi i vitro RdRP analysen (IP-RdRP analyse) for endogene TERT. Denne metode starter med immunoprecipitation (IP) af endogene TERT, og efterfølges af in vitro- RdRP reaktion, hvor radioaktive ribonucleotides er indarbejdet i spirende RNA-strenge.
IP-RdRP-analysen er en følsom metode til at påvise RdRP aktiviteten af menneskelige TERT. TERT protein er stærkt udtrykt i mitotiske HeLa celler, hvor TERT danner RdRP komplekse8,9,10. Dette tyder på, at mitotiske HeLa celler er en optimal materiale til at opdage RdRP aktivitet. I den protokol, der er beskrevet ovenfor, mitotiske og ikke-synkroniseret HeLa celler er inkluderet som et positivt og et negativt eksempel, henholdsvis. Som vist i figur 1A, RdRP assay produkter fra skabelonen anbefalede RNA i mitotiske HeLa celler Vis brede radioaktive signaler mellem 20 til 30 nt. Ud over HeLa celler, vi har udført assay med forskellige typer af cellelinjer, og fandt, at signal mønsteret kan ændres i forskellige celle typer9: nogle viser et stærkt signal kun omkring 30 nt, nogle viser et tilsvarende mønster med HeLa celler. Vi har også udført assay med RNA skabeloner end de 34 nt skabelon8, korte og lange (~ 300 nt) RNA’er med forskellige sekvenser, og med held fremstillet RdRP produkter fra disse skabeloner, selv om der kan være nogle præference. For det første forsøg, men anbefaler vi at bruge HeLa celler i mitotiske fase og skabelonen 34 nt RNA. RdRPs kan generere dobbelt-strenget RNA både en primer-afhængige og en primer-uafhængig måde11. Vi har rapporteret, at TERT bevarer denne egenskab som menneskelige RdRP7,9; TERT syntetiserer dsRNA fra en RNA skabelon med 3′-foldback struktur gennem en back-priming mekanisme7. For skabelonen 34 nt RNA syntetiserer TERT supplerende tråde uden brug af primere9. Specifikt påvise RdRP produkter syntetiseret i en primer-uafhængig måde, dvs de novo syntetiseres RNA produkter, [α –32P] NTP kan erstattes med [γ –32P] NTP i RdRP reaktion9.
MNase behandling af TERT immunkomplekser på perler er et afgørende skridt til at opnå ønskede resultater. Hvis MNase behandlingen er udført for længe eller med intensiv ryster, reduceres RdRP produkter bemærkelsesværdigt. For at undgå sådanne problemer, anbefaler vi kraftigt, til nøje for at følge protokollen nøje. HMD løsning er en anden afgørende faktor for succes. Hvis du finder, at signalerne er meget svag, erstatte HMD løsning til en nypræparerede.
Hele protokollen, bør man tage stor forsigtighed for at undgå RNase forurening. Ribonuklease behandling bør udføres med dedikeret udstyr. Efter manipulere ribonuklease, man bør kassere tips og rør med RNase straks, fjerne RNase med specialiserede løsning (fx RNase stille), og ændre Lunde.
TERT interagerer med ikke kun TERC men også mange slags endogene RNA’er, og vi har rapporteret en del af dem7. Ændring i IP-RdRP analyse, såsom IP-RdRP analysen uden MNase behandling, vil give en fuld liste af endogene RNA skabeloner til TERT-associerede RdRP aktivitet og bioinformatic guide på deres sekvens funktioner. Vi har med succes anvendt denne protokol til væv lysate. Fordi TERT udtrykkes i en bred vifte af normal og tumor væv, kan denne analyse være nyttigt at undersøge ikke-kanoniske enzymatisk funktion af TERT i human.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet i en del af projektet til udvikling af Innovative forskning i kræft Therapeutics (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) og projektet for kræftforskning og terapeutiske Evolution (P-Opret) (16cm 01061150001, K.M.) fra Japan Agency for medicinsk forskning og udvikling, AMED; Takeda Science Foundation (Y.M.); Tilskud af prinsesse Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M.); og JSP’ER KAKENHI tilskud antal JP16K07133 (Y.M.).
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
Fetal bovine serum (FBS) | CORNING | 35-010-CV | |
Penicillin-Streptomycin mixed solution | nacalai tesque | 26253-84 | |
Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution | nacalai tesque | 32777-44 | |
Phosphate buffered saline (PBS(-)) | Wako | 166-23555 | |
Thymidine | nacalai tesque | 07147-61 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | nacalai tesque | 08904-85 | |
Sodium chloride | nacalai tesque | 31333-45 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | nacalai tesque | 35434-21 | |
Hydrochloric acid | nacalai tesque | 18321-05 | |
Nonidet P-40 (NP-40) | nacalai tesque | 25223-04 | |
Pierce Protein A Plus Agarose | Thermo scientific | 22812 | |
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | nacalai tesque | 17514-15 | |
Potassium hydroxide | Wako | 168-21815 | |
Potassium acetate | nacalai tesque | 28405-05 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Wako | 135-00165 | |
Glycerol | nacalai tesque | 17045-65 | |
Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) | Wako | 169-21105 | |
cOmplete, EDTA-free | Roche Applied Science | 11 873 580 001 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) | nacalai tesque | 06731-05 | |
Micrococcal nuclease (MNase) | Takara Bio | 2910A | |
Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | nacalai tesque | 15214-92 | |
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) | nacalai tesque | 07957-64 | |
Dithiothreitol (DTT) | nacalai tesque | 14128-91 | |
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each | Promega | E6000 | |
[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) | PerkinElmer | NEG507H | Use fresh RI for the assay |
RNase inhibitor | TOYOBO | SIN-201 | |
Proteinase K | Takara | 9033 | |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Life Technologies | AM9720 | |
3 M Sodium acetate | NIPPON GENE | 316-90081 | |
Ethanol (99.5) | nacalai tesque | 14713-95 | |
Dr. GenTLE Precipitation Carrier | Takara Bio | 9094 | |
RNase One Ribonuclease | Promega | M4265 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | nacalai tesque | 02873-75 | |
Formamide, deionized | nacalai tesque | 16345-65 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | nacalai tesque | 15130-95 | |
Orange G | nacalai tesque | 25401-22 | |
CO2 incubator | e.g., ASTEC | SCA-325DRS | |
Centrifuge | e.g., TOMY | EX-135 | For step B) |
Micro refrigerated centrifuge | e.g., KUBOTA | 3740 | For step 6.2 |
Sonicator | Qsonica | Q125 | Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4 |
Micro refrigerated centrifuge | e.g., TOMY | MX-305 | For step 6.5 |
Cooled incubator | e.g., Panasonic | MIR-154-PJ | Set a rotary shaker inside |
Rotary shaker | e.g., TAITEC | RT-5 | |
Cooled incubator | e.g., TAITEC | BR-43FL | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7 |
MINI WAVE | AS ONE | WEV-03 | A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6 |
Incubator | e.g., TAITEC | HB-80 | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6 |
Block incubator | e.g., ASTEC | BI-516S |