Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att visa hur cellen photoconversion uppnås genom UV exponering för specifika områden som uttrycker det fluorescerande proteinet, Eos, i levande djur.
Abstract
Djur- och växtarter vävnad består av distinkta populationer av celler. Dessa celler interagerar med tiden att bygga och underhålla vävnaden och kan orsaka sjukdom när störs. Forskare har utvecklat smarta tekniker för att undersöka egenskaper och naturliga dynamiken i dessa celler inom intakt vävnad genom att uttrycka fluorescerande proteiner grupper av celler. Men ibland kräver experiment mer valda visualiseringen av celler i vävnaden, ibland på sätt som encelliga eller befolkningen-i-celler. För att uppnå detta och visualisera enstaka celler inom en population av celler, har forskare utnyttjat encelliga photoconversion av fluorescerande proteiner. För att demonstrera denna teknik, visar vi här hur man direkt UV-ljus till en Eos-uttryckande cell av intresse i en intakt, living zebrafiskar. Vi bild då de photoconverted Eos+ cellerna 24 h senare för att avgöra hur de förändrats i vävnaden. Vi beskriva två teknikerna: enda cell photoconversion och photoconversions av populationer av cellen. Dessa tekniker kan användas för att visualisera cell-cell interaktioner, cell-öde och differentiering och cell migration, vilket gör det en teknik som är tillämpliga i många biologiska frågor.
Introduction
Flera distinkta celler samverkar för att bygga och underhålla komplexa djur- och växtarter vävnader. Dessa celler är ofta ortodoxas och svår att skilja från grannar på en enda cellnivå utan hög upplösning mikroskopi som kräver fixering av vävnad. För att förstå hur dessa vävnader bildar, är underhålls och blir sjuka, har det dock varit nödvändigt att undersöka hur enstaka celler i vävnaden interagerar över tid. Helst kräver dessa experiment märkning av enstaka celler i en vävnad på ett icke-invasivt sätt utan krav på fixering. Forskare har nu utvecklat ett flertal tekniker för att utföra denna uppgift1,2,3,4.
Upptäckten och genomförandet av maneter grönt fluorescerande protein (GFP) var en spännande metod som tillåtna för märkning av olika celler i en vävnad miljö1. Med cell-specifika initiativtagare, är det möjligt att genetiskt välja en delmängd av celler som är märkt1. Alternativt, viral inducerad uttryck för god Jordbrukarsed kan utnyttjas för användarvalda uttryck för god Jordbrukarsed3,4. Även om det är ganska användbart, tillåter genetiska medierade uttryck för god Jordbrukarsed inte användare utvalda uttryck inom en delmängd av celler i vävnaden; och virala uttryck för GFP, även om det är fördelaktigt, kan vara invasiva. Med tillkomsten av GFP derivat och smarta tekniker som Brainbow att uttrycka distinkta fluorescerande proteiner mer glest inom vävnader, har det blivit möjligt att visualisera enstaka celler och interaktioner bland dem i komplexa vävnad2, 5. dock dessa metoder etikett celler på ett slumpmässigt sätt. Om önskad experimentet kräver visualisering av en enstaka cell eller population av celler som definieras av experimenter, är de därför begränsade. Med sådana experiment, skulle det vara fördelaktigt med en genetiskt uttryckt fluorescerande protein som kan manipuleras för att skilja, i en enda cell mode, det från andra lysrör och icke-fluorescerande celler.
För att uppnå detta mål och visualisera cellbiologi enstaka celler inom en komplex levande vävnad, använder det vetenskapliga samfundet enstaka cell photoconversion av distinkta fluorescerande proteiner6,7,8. Med genetiskt kontrollerade uttryck för ett photoconvertible protein (dvs, eos, kaede, etc.) som övergår från en grön till röd fluorescerande tillstånd när den utsätts för UV (488 nm) ljus, vi kan urskilja en enda cell från dess fluorescently märkt grannar6,7,8. Denna strategi använder tredjeparts en apparat kopplad till vår confocal Mikroskop som kan direkt ljus från en laser stack till en diffraktion begränsad region av intresse. Med den här tekniken kan vi antingen märka enskilda celler eller större populationer i ett användardefinierat sätt9,10,11. Tekniken är minimalt invasiva jämfört enda cell injektioner av viral GFP. Som ett proof of concept visar vi att vi kan photoconvert enstaka celler inom en ganglion i perifera nervsystemet och photoconvert större populationer som celler ligger på ventrala sida av ryggmärgen9,10, 11,12. Sedan kan vi visualisera dessa photoconverted cellpopulationer 24 h senare för att få inblick i deras rörelse och differentiering under utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I komplexa vävnader ordna olika cell-typer i specifika domäner. Tekniker har nyligen använts till etikett enskilda celler inom dessa stora vävnad strukturer1,2,3. Här visar vi två tekniker som på samma sätt kan utnyttjas för att visualisera både enstaka cell interaktioner och cell befolkningen interaktioner inom komplexa vävnader. Fördelen med den photoconversion tekniken är den rumsliga kontrollen som forskaren har…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Bernard Kulemaka och medlemmar av Smith lab för deras hjälpsamma kommentarer och reagens vägledning, Sam Connell och Brent Redford av 3i för fielding imaging frågor och Deborah Bang, Karen Heed och Kay Stewart för zebrafiskar vård. Detta arbete stöddes av den University of Notre Dame Elizabeth och Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Center för zebrafiskar forskning vid University of Notre och Center av stamceller och regenerativ medicin vid University of Notre Dame. Alla djurstudier utfördes i enlighet med University of Notre Dame IACUC till Dr Cody Smith.
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
