فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لإظهار كيف يتحقق فوتوكونفيرسيون الخلية من خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية إلى مناطق محددة معربا عن البروتين الفلورسنت، ايوس، في الحيوانات الحية.
Abstract
الأنسجة الحيوانية والنباتية تتكون من السكان متميزة من الخلايا. هذه الخلايا تتفاعل مع مرور الوقت لبناء وصيانة الأنسجة، ويمكن أن يسبب المرض عندما تعطلت. وقد طور العلماء تقنيات ذكية للتحقيق في الخصائص والديناميات الطبيعية من هذه الخلايا داخل أنسجة سليمة بالإعراب عن البروتينات الفلورية في مجموعات فرعية خلايا. ومع ذلك، في بعض الأحيان، تتطلب تجارب أكثر التصور المحدد من الخلايا داخل الأنسجة، أحياناً في طريقة وحيدة الخلية أو السكان من الخلايا. لتحقيق هذا الهدف، ووضع تصور لخلايا مفردة ضمن عدد خلايا، وقد استخدمت العلماء فوتوكونفيرسيون خلية واحدة من البروتينات الفلورية. وللتدليل على هذا الأسلوب، نعرض هنا كيفية توجيه الأشعة فوق البنفسجية إلى خلية ايوس-الإعراب عن اهتمامها حالها، تعيش الزرد. ثم أننا صورة تلك الخلايا ايوس+ فوتوكونفيرتيد 24 ساعة في وقت لاحق لتحديد كيف غيروا في الأنسجة. يمكننا وصف تقنيات اثنين: واحد فوتوكونفيرسيون الخلايا وفوتوكونفيرسيونس من سكان خلية. يمكن استخدام هذه التقنيات لتصور التفاعلات خلية خلية، والخلية-مصير والتمايز، والهجرات الخلية، مما يجعل من أسلوب الذي يطبق في العديد من الأسئلة البيولوجية.
Introduction
تتفاعل عدة خلايا متميزة لبناء وصيانة الأنسجة الحيوانية والنباتية المعقدة. غالباً ما تكون هذه الخلايا المقحم وصعوبة التمييز بين الدول المجاورة على مستوى خلية واحدة دون الفحص المجهري عالية الدقة التي تتطلب تثبيت أنسجة. بيد نفهم كيف أن هذه النماذج الأنسجة، والحفاظ على، وتصبح المريضة، لقد كان ضرورية للتحقيق في كيفية وحيدة الخلايا داخل الأنسجة تتفاعل مع مرور الوقت. ومن الناحية المثالية، تتطلب هذه التجارب تسمية الخلايا المفردة داخل أنسجة بطريقة غير الغازية دون الشرط للتثبيت. وقد طور العلماء الآن العديد من التقنيات لإنجاز هذه المهمة1،2،،من34.
اكتشاف والتنفيذ للبروتين قنديل أخضر نيون (بروتينات فلورية خضراء) هو أحد النهج مثيرة يسمح بوصفها خلايا متميزة في بيئة أنسجة1. استخدام المروجين خلية على حدة، من الممكن تحديد مجموعة فرعية خلايا المسماة1وراثيا. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تستخدم التعبير المستحث الفيروسية للتجارة والنقل للتعبير المستخدم المحدد من بروتينات فلورية خضراء3،4. على الرغم من أن مفيدة للغاية، التعبير وساطة الوراثية للتجارة والنقل لا يسمح بالتعبير المستخدم المحدد ضمن مجموعة فرعية من الخلايا في الأنسجة؛ والفيروسية للتجارة والنقل، على الرغم من أن ميزة، يمكن أن يكون التعبير الغازية. مع ظهور مشتقات التجارة والنقل وتقنيات ذكية مثل برينبوو للتعبير عن البروتينات الفلورية متميزة أكثر قليلة داخل الأنسجة، فقد أصبح من الممكن تصور الخلايا المفردة والتفاعلات فيما بينها في نسيج معقد2، 5-ومع ذلك، هذه النهج تسمية الخلايا بطريقة عشوائية. إذا التجربة المرجوة يتطلب تصور خلية مفردة أو السكان من الخلايا التي يتم تعريفها بالمجرب، لذلك محدودة. مع مثل هذه التجارب، وأنه سيكون من المفيد أن يكون بروتين فلوري أعرب وراثيا التي يمكن التلاعب بها للتمييز، بطريقة وحيدة خلية، فمن الخلايا الفلورسنت وغير الفلورية الأخرى.
لتحقيق هذا الهدف، ووضع تصور لبيولوجيا الخلية من الخلايا المفردة داخل أنسجة حية معقدة، يستخدم المجتمع العلمي فوتوكونفيرسيون خلية مفردة متميزة من البروتينات الفلورية6،،من78. استخدام جينياً الخاضعة للتعبير عن البروتين فوتوكونفيرتيبلي (أي eos، كايد، إلخ) بالانتقال من أخضر إلى الأحمر الدولة الفلورسنت عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية (488 نانومتر) الخفيفة، يمكننا أن نميز خلية واحدة من به المسمى فلوريسسينتلي الجيران6،،من78. وهذا النهج يستخدم جهاز يلحق بنا مجهر [كنفوكل] الذي يمكن توجيه الضوء من كدسة ليزر لمنطقة حيود محدودة الفائدة. مع هذا الأسلوب، ونحن أما تسمية الخلايا المفردة أو عدد أكبر من السكان في طريقة المعرفة من قبل المستخدم10،،من911. هذا الأسلوب مينيملي مقارنة بحقن خلية مفردة من الفيروسية بروتينات فلورية خضراء. كدليل على المفهوم، نظهر أننا يمكن فوتوكونفيرت الخلايا المفردة داخل العقدة في الجهاز العصبي المحيطي وعدد أكبر من السكان فوتوكونفيرت مثل الخلايا الموجودة في الجانب البطني الحبل الشوكي9،10، 11،12. أننا ثم تصور هذه فوتوكونفيرتيد خلية السكان 24 ساعة في وقت لاحق إلى التبصر في حركتهم والتمايز أثناء التطوير.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الأنسجة المعقدة، تنظيم أنواع الخلايا متميزة في مجالات محددة. واستخدمت تقنيات مؤخرا إلى تسمية الخلايا الفردية داخل هذه الأنسجة الكبيرة هياكل1،،من23. هنا نظهر اثنين من التقنيات التي يمكن استخدامها كذلك لتصور التفاعلات وحيد الخلية والخل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر برنارد كوليماكا وأعضاء المختبر سميث لتعليقات مفيدة وتوجيهات الكاشف، سام كونيل وريدفورد برنت من 3i لإيفاد التصوير الأسئلة والدوي ديبورا وتعير كارين ستيوارت كاي للرعاية الزرد. أيده هذا العمل في جامعة نوتردام، أن إليزابيث ومايكل غالاغر الأسرة، ومؤسسة الفريد سلون ص، مركز للبحوث الزرد في جامعة نوتردام ومركز للخلايا الجذعية والطب التجديدي في جامعة نوتردام سيدة. وأجريت جميع الدراسات الحيوانية امتثالا لجامعة نوتردام IACUC للدكتور سميث كودي.
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
