Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vise, hvordan cellen photoconversion er opnået gennem UV eksponering for specifikke områder at udtrykke de fluorescerende proteiner, Eos, med levende dyr.
Abstract
Dyre- og plantearter væv er sammensat af forskellige populationer af celler. Disse celler interagerer over tid at opbygge og vedligeholde væv og kan forårsage sygdom når forstyrret. Forskere har udviklet smarte teknikker til at undersøge karakteristika og naturlige dynamik i disse celler i intakt væv ved at udtrykke fluorescerende proteiner i delmængder af celler. Dog til tider kræver eksperimenter mere valgte visualisering af celler inden for væv, undertiden på den encellede eller befolkning af celler måde. For at opnå dette og visualisere enkelt celler i en befolkning på celler, har forskere udnyttet encellede photoconversion af fluorescerende proteiner. For at demonstrere denne teknik, viser vi her hvordan direkte UV-lys til et Eos-udtrykker celle af interesse i en intakt, lever zebrafisk. Vi image derefter disse photoconverted Eos+ celler 24 timer senere for at afgøre, hvordan de ændrede i vævet. Vi beskrive to teknik: enkelt celle photoconversion og photoconversions af populationer af celle. Disse teknikker kan bruges til at visualisere celle-celle interaktioner, celle-skæbne og differentiering og celle migrationer, hvilket gør det en teknik, der er gældende i mange biologiske spørgsmål.
Introduction
Flere forskellige celler interagere at opbygge og opretholde komplekse dyre- og plantearter væv. Disse celler er ofte indtrængere og vanskelige at skelne fra naboer på en enkelt celle niveau uden høj opløsning mikroskopi, der kræver fiksering af væv. Men for at forstå, hvordan disse væv form, er fastholdt, og blive syge, det har været nødvendigt at undersøge, hvordan enkelt celler inden for væv interagerer over tid. Ideelt, kræver disse eksperimenter, mærkning af enkelt celler i et væv i en ikke-invasiv måde uden kravet om fiksering. Forskere har nu udviklet mange teknikker til at udføre denne opgave1,2,3,4.
Opdagelsen af og gennemførelse af vandmænd grøn fluorescerende proteiner (NGL) var en spændende tilgang, der er tilladt for mærkning af forskellige celler i en væv miljø1. Via celle-specifikke initiativtagere, er det muligt at genetisk vælge et undersæt af celler, der er mærket1. Alternativt, viral induceret udtryk for normal god landbrugspraksis kan udnyttes til bruger-valgte udtryk for normal god landbrugspraksis3,4. Selvom ganske nyttigt, tillader genetiske medieret udtryk for normal god landbrugspraksis ikke brugervalgte udtryk inden for en delmængde af celler i vævet; og viral udtryk for normal god landbrugspraksis, selv om fordelagtige, kan være invasive. Med fremkomsten af normal god landbrugspraksis derivater og smarte teknikker som Brainbow til at udtrykke forskellige fluorescerende proteiner mere sparsomt i væv, er det blevet muligt at visualisere enkelt celler og interaktioner blandt dem i komplekse væv2, 5. men disse tilgange label celler i en tilfældig måde. Hvis den ønskede eksperiment kræver visualisering af en enkelt celle eller befolkning af celler, der er defineret af eksperimentatoren, er de derfor begrænset. Med sådanne eksperimenter, ville det være en fordel at have en genetisk udtrykt fluorescerende proteiner, der kan manipuleres til at skelne, i en enkelt celle mode, det fra andre fluorescerende og ikke-fluorescerende celler.
For at nå dette mål og Visualiser cellebiologi af enkelt celler i et komplekst levende væv, bruger det videnskabelige samfund enkelt celle photoconversion af forskellige fluorescerende proteiner6,7,8. Ved hjælp af genetisk kontrolleret udtryk for en photoconvertible protein (i.e., eos, kaede, osv.), der overgange fra en grøn til rød fluorescerende tilstand når den udsættes for UV (488 nm) lys, vi kan skelne en enkelt celle fra sin fluorescently mærket naboer6,7,8. Denne metode udnytter et apparat, der er knyttet til vores Konfokal mikroskop, som kan direkte lys fra en laser stak en diffraktion-begrænset region af interesse. Med denne teknik, kan vi enten mærke enkelt celler eller større populationer i en brugerdefineret måde9,10,11. Teknikken er minimalt invasiv sammenlignet med enkelt celle injektioner af viral normal god landbrugspraksis. Som en proof of concept viser vi, at vi kan photoconvert enkelt celler i en ganglion i de perifere nervesystem og photoconvert større befolkningsgrupper, som cellerne ligger på den ventrale side af rygmarven9,10, 11,12. Vi kan derefter visualisere disse photoconverted cellepopulationer 24 timer senere for at få indblik i deres bevægelse og differentiering under udvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I komplekse væv organisere særskilt celletyper i bestemte domæner. Seneste har teknikker været udnyttet til etiketten individuelle celler inden for disse store væv strukturer1,2,3. Her viser vi to teknikker, der kan ligeledes udnyttes til at visualisere både enkelt celle interaktioner og celle befolkning interaktioner i komplekse væv. Fordelen ved photoconversion teknikken er fysisk kontrol videnskabsmanden har tydeligt m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bernard Kulemaka og medlemmer af Smith lab for deres nyttige bemærkninger og reagens vejledning, Sam Connell og Brent Redford af 3i for fielding imaging spørgsmål og Deborah Bang, Karen Heed og Kay Stewart for zebrafisk pleje. Dette arbejde blev støttet af University of Notre Dame, Elizabeth og Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Center for zebrafisk forskning på University of Notre og centrum af stamceller og regenerativ medicin ved University of Notre Dame. Alle animalske undersøgelser blev udført i overensstemmelse med University of Notre Dame IACUC til Dr. Cody Smith.
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
