सिंगल सेल Photoconversion में रह Zebrafish बरकरार
Summary
यहां, हम दिखाने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान कैसे सेल photoconversion विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन, Eos, रहने वाले पशुओं में व्यक्त क्षेत्रों के लिए यूवी जोखिम के माध्यम से हासिल की है ।
Abstract
पशु और संयंत्र ऊतक कोशिकाओं की अलग आबादी से बना है । इन कोशिकाओं को समय के निर्माण और बनाए रखने के ऊतकों पर बातचीत और रोग का कारण बन सकता है जब बाधित । वैज्ञानिकों चालाक तकनीकों कोशिकाओं के सबसेट में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त द्वारा बरकरार ऊतक के भीतर इन कोशिकाओं की विशेषताओं और प्राकृतिक गतिशीलता की जांच करने के लिए विकसित किया है । हालांकि, कई बार, प्रयोगों में ऊतक के भीतर कक्षों के अधिक चयनित विज़ुअलाइज़ेशन की आवश्यकता होती है, कभी-कभार एकल-कक्ष या जनसंख्या-कक्ष तरीके से. इस लक्ष्य को प्राप्त करने और कोशिकाओं की आबादी के भीतर एकल कोशिकाओं कल्पना, वैज्ञानिकों फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एकल सेल photoconversion का उपयोग किया है । इस तकनीक का प्रदर्शन, हम यहां दिखाने के लिए कैसे एक Eos-एक बरकरार, रहने zebrafish में ब्याज की सेल व्यक्त करने के लिए यूवी प्रकाश प्रत्यक्ष । हम तो उन photoconverted Eos+ कोशिकाओं 24 h बाद में निर्धारित करने के लिए कि वे कैसे ऊतक में बदल छवि । हम दो तकनीकों का वर्णन: सेल की आबादी के एकल सेल photoconversion और photoconversions । इन तकनीकों सेल सेल बातचीत, सेल भाग्य और भेदभाव, और सेल प्रवास कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह एक तकनीक है कि कई जैविक प्रश्नों में लागू है बना रही है ।
Introduction
एकाधिक अलग कोशिकाओं के निर्माण और जटिल पशु और संयंत्र के ऊतकों को बनाए रखने के लिए बातचीत । इन कोशिकाओं को अक्सर intercalated और उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी कि ऊतक के निर्धारण की आवश्यकता के बिना एक एकल कोशिका स्तर पर पड़ोसियों से अलग करने के लिए मुश्किल हैं. हालांकि, समझने के लिए कैसे इन ऊतकों के रूप, बनाए रखा है, और रोगग्रस्त हो जाते हैं, यह जांच करने के लिए आवश्यक हो गया है कि कैसे ऊतक के भीतर एक कोशिकाओं को समय के साथ बातचीत कर रहे हैं । आदर्श रूप में, इन प्रयोगों एक गैर इनवेसिव तरीके से एक ऊतक के भीतर एकल कोशिकाओं के लेबल निर्धारण की आवश्यकता के बिना की आवश्यकता है । वैज्ञानिकों ने अब कई तकनीक विकसित की है इस कार्य को पूरा करने के लिए1,2,3,4।
खोज और जेलिफ़िश ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कार्यांवयन (GFP) एक रोमांचक दृष्टिकोण है कि एक ऊतक पर्यावरण1में अलग कोशिकाओं के लेबल के लिए अनुमति दी गई थी । कक्ष-विशिष्ट प्रवर्तकों का उपयोग करके, यह संभव है कि1लेबल किए गए कक्षों के किसी सबसेट का आनुवंशिक रूप से चयन करें । वैकल्पिक रूप से, GFP के वायरल प्रेरित अभिव्यक्ति GFP3,4के उपयोगकर्ता चयनित अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जा सकता है । हालांकि काफी उपयोगी, GFP की आनुवंशिक मध्यस्थता अभिव्यक्ति ऊतक में कोशिकाओं के एक सबसेट के भीतर उपयोगकर्ता-चयनित अभिव्यक्ति की अनुमति नहीं है; और GFP के वायरल अभिव्यक्ति है, हालांकि लाभप्रद, आक्रामक हो सकता है । GFP डेरिवेटिव और Brainbow तरह चालाक तकनीक के आगमन के साथ विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन और अधिक विरल ऊतकों के भीतर व्यक्त करने के लिए, यह एक कोशिकाओं कल्पना और जटिल ऊतक में उन के बीच बातचीत करने के लिए संभव हो गया है2, 5. हालांकि, इन दृष्टिकोण एक यादृच्छिक फैशन में लेबल कोशिकाओं । यदि वांछित प्रयोग को किसी एकल कक्ष या उन कक्षों की जनसंख्या के विज़ुअलाइज़ेशन की आवश्यकता होती है जो experimenter द्वारा परिभाषित किए जाते हैं, तो वे इसलिए सीमित हैं. ऐसे प्रयोगों के साथ, यह एक आनुवंशिक रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि अलग करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है लाभप्रद होगा, एक ही सेल फैशन में, यह अन्य फ्लोरोसेंट और गैर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं से.
इस लक्ष्य को प्राप्त करने और एक जटिल रहने वाले ऊतक के भीतर एकल कोशिकाओं के सेल जीवविज्ञान कल्पना, वैज्ञानिक समुदाय विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन6,7,8के एकल कोशिका photoconversion का उपयोग करता है । एक photoconvertible प्रोटीन की आनुवंशिक रूप से नियंत्रित अभिव्यक्ति का उपयोग (यानी, eos, kaede, आदि) है कि एक हरे रंग से लाल फ्लोरोसेंट राज्य के लिए संक्रमण जब यूवी (488 एनएम) प्रकाश को उजागर, हम अपनी फ्लोरोसेंट लेबल से एक एकल कोशिका भेद कर सकते है पड़ोसियों6,7,8। इस दृष्टिकोण एक हमारे फोकल माइक्रोस्कोप जो एक लेजर से प्रकाश प्रत्यक्ष कर सकते है के लिए संलग्न तंत्र का इस्तेमाल एक विवर्तन ब्याज की सीमित क्षेत्र में ढेर । इस तकनीक के साथ, हम या तो एक प्रयोक्ता में एक कोशिकाओं या बड़ी आबादी लेबल कर सकते है निर्धारित तरीके से9,10,11। तकनीक वायरल GFP के एकल सेल इंजेक्शन की तुलना में न्यूनतम इनवेसिव है । अवधारणा का एक सबूत के रूप में, हम बताते है कि हम परिधीय तंत्रिका तंत्र में एक नाड़ीग्रंथि के भीतर एकल कोशिकाओं photoconvert कर सकते है और photoconvert रीढ़ की हड्डी के ventral ओर स्थित कोशिकाओं की तरह बड़ी आबादी9,10, 11,12. हम तो इन photoconverted सेल आबादी 24 ज बाद में अपने आंदोलन और विकास के दौरान भेदभाव में अंतर्दृष्टि हासिल कल्पना कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
जटिल ऊतकों में, विशिष्ट सेल प्रकारों को विशेष डोमेन में व्यवस्थित करता है । हाल ही में तकनीक के लिए इन बड़े ऊतक संरचनाओं के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं लेबल1,2,3का उपयोग कि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम बर्नार्ड Kulemaka और उनके सहायक टिप्पणियां और मार्गदर्शन के लिए स्मिथ लैब के सदस्यों को धंयवाद, सैम Connell और 3i के ब्रेंट Redford इमेजिंग सवाल और दबोरा बैंग, करेन रस्ते और zebrafish देखभाल के लिए Kay स्टीवर्ट के लिए । यह काम Notre डेम, एलिजाबेथ और माइकल Gallagher परिवार, अल्फ्रेड पी Sloan फाउंडेशन, Notre विश्वविद्यालय में Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र और स्टेम सेल और Notre विश्वविद्यालय में अपक्षयी दवा के केंद्र में विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था डेम. सभी पशु अध्ययन विश्वविद्यालय Notre डेम IACUC के साथ डॉ कोड़ी स्मिथ के अनुपालन में किया गया था ।
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
