여기, 우리가 어떻게 셀 photoconversion 형광 단백질, Eos, 살아있는 동물을 표현 하는 특정 영역에 자외선 노출을 통해 이루어집니다 보여 프로토콜 제시.
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이 논문에서
요약
초록
동물 및 식물 조직 세포의 명료한 인구로 구성 됩니다. 이러한 셀 구축 하 고 조직 유지 시간에 따라 상호 작용 하 고 질병 중단 하는 경우 발생할 수 있습니다. 과학자 들은 셀의 하위 집합에 형광 단백질을 표현 하 여 특성과 그대로 조직 내 이러한 세포의 자연 역학 조사를 영리한 기술을 개발 했습니다. 그러나, 실험 시간에 단일 셀 또는 셀 인구 방식에 때로는 조직 내의 셀의 선택 된 시각화 더 필요합니다. 하이 고 셀의 인구 내의 단일 셀을 시각화, 과학자는 형광 단백질의 단일 셀 photoconversion를 활용 하 고. 이 기법을 보여, 우리 여기 어떻게 보여 UV 빛을 지시는 그대로의 Eos 표현 셀 zebrafish 생활. 우리는 다음 그들이 어떻게 조직에 변경 확인 하 photoconverted Eos+ 셀 24 h 나중 이미지. 우리는 두 가지 기술을 설명: 셀 photoconversion 및 photoconversions의 세포의 인구. 이 기술은 세포 세포 상호 작용, 세포 운명 및 차별화, 그리고 셀 마이그레이션, 그건 수많은 생물학 질문에 적용 하는 기술 시각화를 사용할 수 있습니다.
서론
여러 가지 셀 구축 하 고 복잡 한 동물 및 식물 조직 유지 작용. 이 세포는 종종 삽입 하 고 조직의 고정을 필요로 하는 높은 해상도 현미경 없이 단일 세포 수준에서 이웃에서 구별 하기 어려운. 그러나, 이해 하 고 어떻게 이러한 조직 형태는 유지, 고 병 될, 그것 되었습니다 어떻게 단일 조직 내의 세포 조사 필수 상호 작용 하는 시간이 지남에. 이상적으로, 이러한 실험 정착의 요구 사항 없이 비 침략 적 방식으로 조직 내의 단일 셀의 라벨 필요 합니다. 과학자는 지금이 작업1,2,,34를 달성 하기 위해 수많은 기술을 개발 했다.
발견과 해파리의 녹색 형광 단백질 (GFP)의 구현1조직 환경 개별 셀의 라벨에 대 한 허용 한 흥미로운 접근 했다. 셀-특정 발기인을 사용 하 여, 유전자는1을 표시 하는 셀의 하위 집합을 선택 가능 하다.입니다. 또는, GFP의 바이러스 성 유도 식 GFP3
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프로토콜
모든 동물 연구는 노 틀 담 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 제 브라 견본 준비
- 표준 절차13당 짝짓기 챔버로 한 성인 남자와 한 성인 여성 Tg (컨버터블 단백질)를 배치 합니다. 이 원고에서는 Tg(sox10:eos)를 물고기9 액세스 하지만 photoconvertible 단백질으로 다른 유전자 변형 라인을 동등 하 게 사용 될 수 있다. 물고기 놓지 않는 경우 더 이상의 챔버를 설정 합니다. 챔버에 남아 하룻밤을 물고기 허용.
- 다음날 아침, 100 mm 페 트리 접시에 달걀을 수집 합니다. 심사 하기 전에 24 시간 후 수정 (hpf) 성숙 계란을 허용 합니다.
- 위의 동물 heterozygotes는 transgene에 대 한 경우, 화면 24 hpf 요리 Tg(sox10:eos) + 488 nm 광원 및 GFP 배아에 대 한 필터링 해 현미경에 세트. Tg(sox10:eos) + 배아를 분리 하 고 48 성숙 허용 hpf.
- 바늘 또는 핀셋으로 수동으로 Dechorionate 배아
- 준비 하 고 0.8% 낮은 녹는 포인트 agar....
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결과
Photoconversion 형광 단백질의 조직6내에서 개별 셀을 사용할 수 있습니다. 이 보여, Tg(sox10:eos) 물고기9 sox10의 규제 시퀀스에서 photoconvertible 단백질 Eos 표현 하 사용 되었다. 48 Tg(sox10:eos) 동물 hpf 했다 처음 탑재, 그리고 다음 발생 했을 수 있는 일반적인 photoconversion 감지 하 군데. Eos Eos photoconverted 형광 신호 작은 비전향된 형광 신호는 다음 시각화 (그림 10). 동물은 일반적인 photoconversion는 최소 보장 하기 위해 어둠 속에서 유지 했다. 그럼, 관심 영역 confocal 현미경 설정을 사용 하 여 자외선에 노출 되었다. 확인 하려면 단일 셀 UV 노출의 .......
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토론
복잡 한 조직에서 다른 세포 유형 특정 도메인으로 구성합니다. 최근 기술 이러한 큰 조직 구조1,2,3내에서 개별 셀 라벨에 이용 되어 있다. 여기 마찬가지로 단일 세포 상호 작용 및 복잡 한 조직 내의 세포 인구 상호 작용을 시각화를 활용할 수 있는 두 가지 방법을 설명 합니다. Photoconversion 기술의 장점은 분명히 셀 라벨 과학자는 공간 제어입니다. 능력을 더 작은 노출은 현미경으로 큰 이미지 창에서 영역 지역으로 단일 세포 또는 단일 셀의 다른 세포와는 다르게 표시 될 수 있습니다 작은 이미지입니다. 지금 여러 photoconvertible 단백질이 더 광범위 하 게 기술7을 만드는 사회에 도입 되었습니다. Photoconvert 단백질을 세포 내에서 능력, 과학자는이 기술 또는 셀 마이그레이션, 세포 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리가 버나드 Kulemaka 및 그들의 도움이 의견과 시 지도, 샘 Connell 및 이미징 질문 및 데보라 뱅, 카 렌 주 및 케이 스튜어트 zebrafish 치료 비 위한 3i의 브렌 트 레드에 대 한 스미스 연구소의 회원을 감사 합니다. 이 작품 노 대학 및 줄기 세포의 센터에서 Zebrafish 연구 노 대학에서 재생 의학에 대 한 노트르담의, Elizabeth와 마이클 갤러거 가족, 알프레드 P. 슬로 안 재단, 센터에 의해 지원 되었다 담입니다. 모든 동물 연구 박사 코디 스미스의 Notre Dame 대학 IACUC에 따라 수행 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Tg(sox10:eos) 제브라피쉬 동물 | fish는 노트르담 대학교의 어류 시설에서 얻어져 교배되었습니다. | ||
| 100 X 15 mm 페트리 접시 | VWR | 25384-302 | |
| 배아 매체 | 배아 배지는 매주 만들어지며 5L RO 물, 30uL 메틸렌 블루 및 200mL 소금 스톡을 포함하는 노트르담 대학교의 어류 시설에서 제공합니다. | ||
| 0.8 % 낮은 융점 Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm 유리 커버 슬립 바닥 페트리 접시 | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| 바늘 해부 프로브 | |||
| 0.002% 3-아미노벤조산 에스테르(트리카인) | Fluka 분석 | A5040-250G | |
| GFP 필터가 있는 형광 해부 현미경 | Zeiss Axiozoom | ||
| 컨포칼 현미경 | 3i 회전 디스크 컨포칼 | ||
| 광 변환 용 UV 광원 (레이저) | 405nm 레이저 | ||
| 슬라이드 북 소프트웨어 | 3i | ||
| 메틸렌 블루 | Kordon |
참고문헌
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent prot....
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재인쇄 및 허가
