生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電
Summary
ここでは、蛍光蛋白質、Eos、生きている動物の表現する特定の領域に紫外線暴露により光電セルを達成する方法を表示するためのプロトコルを提案する.
Abstract
動物や植物の組織細胞の異なる集団で構成されます。これらの細胞と組織を維持・構築に時間をかけて対話中断されるとき病気を引き起こすことができます。科学者は、細胞のサブセットに蛍光蛋白質を表現することによって特徴とそのまま組織内でこれらの細胞の自然動態を調査するためのテクニックを開発しました。しかし、時は、実験は時単一細胞または細胞の人口のように、組織内の細胞より選択した可視化する必要があります。科学者はこれを実現し、セルの人口内の単一のセルを可視化する蛍光タンパク質の単一セルの光電を活用しています。このテクニックを示すためには、方法を示しますここをそのまま、興味の Eos を表現する細胞に UV ライトを指示するゼブラフィッシュの生活します。私たちは、どのように彼らは組織の変更を確認するそれらの photoconverted Eos+セル 24 時間後をイメージします。二つの手法: 単一セルの光電とセルの人口の photoconversions。これらの技術は、細胞間相互作用、細胞運命と分化、細胞移動、作りそれ多数の生物的質問に適用する技術を視覚化する使用できます。
Introduction
複数の異なる細胞が複雑な動物や植物の組織の維持・構築に対話します。これらの細胞は、インターカ レートとティッシュの固定を必要とする高分解能顕微鏡なしの単一セルのレベルで近所の人から区別することは困難。しかし、どのようにこれらの組織フォームを理解、維持、病気になるには、組織内の単一のセルを調べることが不可欠がされて時間をかけて相互作用しています。理想的には、これらの実験は、固定する必要がなく非侵襲的な方法で組織内の単一セルのラベルを必要とします。科学者は今この作業1,2,3、4を達成するために多数の技術を開発しました。
発見とクラ ゲの緑色蛍光タンパク質 (GFP) の実装は、組織環境1の異なるセルのラベルの 1 つの刺激的なアプローチだった。細胞特異的発現プロモーターを使用して、それは遺伝子1のラベルが付いているセルのサブセットを選択することが可能です。また、GFP3,4のユーザー選択式の GFP の発現するウイルスを利用できます。GFP 発現の遺伝的媒介が; 組織における細胞のサブセットの内でユーザーが選択した式を許可しませんが、非常に便利でき、GFP のウイルス発現が有利な侵襲的です。単一細胞および複雑な組織2,でそれらの間の相互作用を視覚化することが可能なっている GFP 誘導体および Brainbow 組織内よりまばら異なる蛍光蛋白質を表現するような巧妙な技術の出現で、5します。 ただし、これらのアプローチがランダムな方法で細胞をラベルします。目的の実験には、単一細胞の可視化や実験者によって定義されているセルの人口が必要とする場合そのため制限されます。そのような実験と区別する単一のセル方式で操作できる遺伝子発現蛍光タンパク質を持っているに有利であろう他の蛍光・非蛍光性の細胞から。
この目標を達成するため、複雑な生体組織内の単一セルの細胞生物学を視覚化は、科学的なコミュニティは、異なる蛍光タンパク質6,7,8の単一セルの光電を使用します。緑から赤の蛍光状態紫外線にさらされたときに移行蛍光蛋白質 (すなわち、eos、楓等) の表現を制御する遺伝子を使用して (488 nm) 光、我々 は蛍光に分類されたからの単一のセルを区別できます。隣人6,7,8。このアプローチは、回折限界領域にレーザー スタックからライトを指示することができます私たちの共焦点の顕微鏡に接続されている装置を利用しています。この手法により、我々 はどちらか単一セルまたはユーザー定義の方法9,10,11より大きい人口ラベルできます。手法は、ウイルス ・ GFP の単一細胞注射に比べて低侵襲です。Photoconvert 末梢神経系と脊髄9,10の腹側に位置する細胞のようなより大きい人口を photoconvert 神経節内の単一細胞ことを示して我々 の概念の証拠として 11,12。彼らの動きや開発中に分化に洞察力を得るためにこれら photoconverted のセル人口 24 h 後、視覚化できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
複雑な組織の種類セルは特定のドメインに整理します。最近の技術はこれらの大規模な組織の構造の1,2,の3の内で個々 のセルをラベルに利用されています。単一細胞の相互作用および複雑な組織内で細胞人口の相互作用を視覚化する同様に利用できる 2 つの手法を示します。光電技術の利点は、科学者はセルをはっきりと…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ベルナール ・ Kulemaka とサム ・ コネルとブレント レッドフォード 3i ゼブラフィッシュ ケアのため画像の質問とデボラ ビッグバン カレン耳を傾ける、ケイ ・ スチュワートの守備のための有用なコメントと試薬指導、スミス研究室のメンバーに感謝しますこの作品は、ゼブラフィッシュ研究幹細胞のセンターとノートルダム大学とノートルダム大学で再生医療のノートルダム大学、エリザベスとマイケル ・ ギャラガー家族、アルフレッド ・ p. スローン財団、センターによって支えられました。大聖堂。すべての動物の研究は、博士コーディ スミスに IACUC ノートルダム大学に準拠して行われました。
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
