Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

Summary

Nous présentons ici un test de perméabilité vasculaire de cerveau de souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion qui s’applique aux modèles animaux du dysfonctionnement de la barrière hémato – encéphalique. Un hemi-cerveau est utilisé pour évaluer la perméabilité quantitativement et l’autre pour traceur visualisation/immunostaining. La procédure prend 5 à 6 h pour 10 souris.

Abstract

Barrière hémato – encéphalique (BHE) est une barrière spécialisée qui protège le microenvironnement de cerveau de toxines et d’agents pathogènes dans la circulation et maintient l’homéostasie du cerveau. Les sites principaux de la barrière sont des cellules endothéliales des capillaires cerveau dont la fonction barrière résulte des jonctions intercellulaires et transporteurs d’efflux exprimées sur la membrane plasmique. Cette fonction est régie par les péricytes et astrocytes qui forment ensemble l’unité neurovasculaire (UNV). Plusieurs maladies neurologiques telles que des accidents vasculaires cérébraux, la maladie d’Alzheimer (ma), les tumeurs cérébrales sont associées à une fonction altérée de BBB. Évaluation de la perméabilité BBB est donc essentielle pour évaluer la gravité de la maladie neurologique et le succès des stratégies de traitement employées.

Nous présentons ici un simple, pourtant test de perméabilité robustes qui ont été appliqués avec succès à plusieurs souris modèles génétiques et expérimentale. La méthode est très quantitative et objective par rapport à l’analyse de fluorescence du traceur par microscopie qui est couramment appliquée. Dans cette méthode, les souris sont injectés par voie intrapéritonéale avec un mélange de solution aqueuses traceurs fluorescents inertes suivie d’anesthésier les souris. La perfusion cardiaque des animaux est effectuée avant leur récolte de cerveau, des reins ou des autres organes. Organes sont homogénéisés et centrifugés suivie par mesure de la fluorescence du surnageant. Tirés de la ponction cardiaque juste avant la perfusion de sang sert pour le but de la normalisation dans le compartiment vasculaire. La fluorescence de tissu est normalisée à la fluorescence de sérum et poids humide pour obtenir un quantitatif indice de perméabilité de traceur. Pour une confirmation supplémentaire, hemi-cerveau controlatérale préservé pour immunohistochemistry peut être utilisé à traceurs fluorescence visualisation des fins.

Introduction

La barrière sang – encéphalique (BHE) se compose des cellules endothéliales microvasculaires (ECs) pris en charge par des péricytes étroitement associés (SCP), qui sont entourées dans la lame basale, et les astrocytes (ACs) qui enveloppent la membrane basale avec leurs embouts^{1 ,2}. ECs interagissent avec plusieurs types de cellules qui soutiennent et régulent la fonction de barrière, principalement les ACs et les PC, et aussi les neurones et les cellules microgliales, qui ensemble constituent l’unité neurovasculaire (UNV). Le NVU est critique pour la fonction de la BHE, qui limite le transport des toxines véhiculées par le sang et les agents pathogènes de pénétrer dans le cerveau. Cette fonction est le résultat de la jonction serrée molécules tels que claudin-5, occludin, zonula occludens-1, qui se trouvent entre l’ECs et aussi grâce à l’action des transporteurs comme la p-glycoprotéine (P-gp) cet efflux de molécules qui entrent dans l’endothélium de nouveau dans le navire lumen^1,2,3. Le BBB permet toutefois pour le transport de molécules essentielles comme les nutriments (glucose, fer, acides aminés) par des transporteurs spécifiques exprimés sur les membranes plasmiques de ce^1,2,3. La couche d’EC est fortement polarisée en ce qui concerne la répartition des différents transporteurs entre la luminale (sang-face) et abluminal (cerveau face à membranes) pour permettre le transport spécifique et vectoriel fonction^4,5 . Alors que la BHE est protectrice à l’égard de bien réguler le milieu de la CNS, c’est un défi majeur pour l’administration de médicaments CNS dans des maladies comme la maladie de Parkinson avec un BBB fonctionnel. Même dans les maladies neurologiques présentant une dysfonction BBB, on ne peut présumer que l’administration de médicaments du cerveau augmente autant que le dysfonctionnement de la barrière pourrait inclure des dégâts aux cibles transporteur spécifique par exemple comme dans la maladie d’Alzheimer (ma). Dans AD, plusieurs transporteurs de bêta-amyloïde comme LRP1, RAGE, P-gp sont connus pour être dysrégulation et donc cibler ces transporteurs pourrait être futile^6,7,8. Le BBB est altérée chez plusieurs maladies neurologiques comme la méningite AVC, AD, sclérose en plaques- et du cerveau tumeurs^9,10,11. Restaurer la fonction barrière est un élément crucial de la stratégie thérapeutique et son évaluation est donc critique.

Dans ce travail, nous avons décrit une objective et quantitative protocole pour l’analyse de la perméabilité chez les rongeurs que nous avons appliqué avec succès à plusieurs lignées de souris les deux maladies expérimentales et transgéniques modèles^{10,12,13 ,},¹⁴. La méthode est basée sur une simple injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion des souris pour enlever les traceurs du compartiment vasculaire. Cerveau et autres organes sont prélevés post perfusion et évalués par un objectif de perméabilité et indice de perméabilité absolue fondée sur des mesures de fluorescence des homogénats de tissus dans un lecteur de plaque. Toutes les valeurs brutes de fluorescence ont été corrigés pour l’arrière-plan à l’aide d’homogénats de tissus ou de sérum provenant d’animaux d’imposture qui ne reçoivent pas tous traceur. Un grand normalisations sont incluses pour volume de sérum, sérum fluorescence et le poids des tissus, produisant ainsi des index de perméabilité qui est absolu et comparables entre les expériences et les types de tissus. Pour faciliter la comparaison entre les groupes, les valeurs d’index de perméabilité absolue peuvent se transformer facilement ratios que nous avions effectué précédemment¹². Parallèlement, stockée hemi-cerveau et les reins pourraient être utilisés pour la visualisation du traceur par microscopie de fluorescence¹⁰. La microscopie de fluorescence classique pourrait être utile à obtenir une différence régionale perméabilité quoique encombrant en raison de la sélection subjective de coupes de tissus et d’images pour une analyse semi-quantitative. Les étapes détaillées sont présentées dans le protocole et les notes sont ajoutées, le cas échéant. Ceci fournit les informations nécessaires pour effectuer avec succès le test de perméabilité in vivo chez la souris qui peuvent être adaptés à d’autres petits animaux. Le test peut être appliqué à beaucoup de genres de traceurs permettant la charge et la taille fondé l’évaluation de la perméabilité par une combinaison de traceurs avec les spectres de fluorescence distinctes.

Protocol

Tous les animaux ont été traités avec soin, minimisant la douleur ou l’inconfort lors de la procédure. Cette procédure suit les directives de protection des animaux de notre institution et a été approuvée par le Comité local (Regierungspraesidium Darmstadt, numéro d’homologation FK/1044). Un schéma des étapes de travail pour l’analyse perméabilité in vivo chez la souris est illustré à la Figure 1. Les détails de chaque étape sont d…

Representative Results

Nous avons récemment démontré que les souris angiopoietin-2 (Ang-2) gain de fonction (GOF) ont la perméabilité vasculaire cérébrale plus élevée que les souris témoins dans des conditions de salubrité10. Chez les souris induite par l’accident vasculaire cérébral, il était aussi montre que les souris GOF avaient de plus grandes tailles d’infarctus et d’une plus grande perméabilité que la portée du contrôle. Ces résultats montrent un rôle cru…

Discussion

Dysfonctionnement de la barrière hémato – encéphalique est associé à un certain nombre de troubles neurologiques, y compris les tumeurs cérébrales primaires et secondaires ou accident vasculaire cérébral. Rupture BBB est souvent associé avec oedème de CNS mortelles. L’élucidation des mécanismes moléculaires qui déclenchent l’ouverture ou la fermeture de la BHE est donc d’importance thérapeutique dans les troubles neurologiques et généralement étudié par les chercheurs. Cependant, méthodes pour …

Materials

Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD	Thermosfisher	D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD	Thermosfisher	D3306
Ketamine (Ketavet)	Zoetis
Xylazine (Rompun)	Bayer
0.9% Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS	Gibco	10010-015
Tissue-tek O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
37% Formaldhehyde solution	Sigma	252549-1L	prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V	Roth	8076.3
Triton X-100	Sigma	T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3	BD Pharmingen	553370
goat anti rat alexa 568	Molecular Probes	A-11077
goat anti rat alexa 488	Molecular Probes	A-11006
DAPI	Molecular Probes	D1306
Aqua polymount	Polyscience Inc	18606
21-gauge butterfly needle	BD	387455
serum collection tube	Sarstedt	41.1500.005
2mL eppendorf tubes	Sarstedt	72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers	Kimberley-Clark Professional	05511
384-well black plate	Greiner	781086
slides superfrost plus	Thermoscientific	J1800AMNZ
PTFE pestle	Wheaton	358029
electric overhead stirrer	VWR	VWR VOS 14
plate reader	Tecan	Infinite M200
Cryostat	Microm GmbH	HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System	Nikon
peristaltic perfusion system	BVK Ismatec
microcentrifuge	eppendorf	5415R