Summary

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

Published: May 10, 2019
doi:

Summary

אנו מתארים הוראות צעד אחר צעד ל: 1) ביעילות מהנדס מעיים אורגנואידים באמצעות ננו חלקיקים מגנטיים עבור התמרה-או כפוף, ו, 2) ליצור קטעים קפואים מן הנדסה ארגונית. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לשנות ביעילות ביטוי גנים באורגנואידים לחקירת השפעות במורד הזרם.

Abstract

תרבויות מעיים מספק הזדמנות ייחודית לחקור את תא גזע המעיים וביולוגיה קריפטה בתחום החוץ, למרות שגישות יעילות לתמרן ביטוי גנים באורגנואידים עשו התקדמות מוגבלת בזירה זו. בעוד CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מאפשרת עריכת הגנום מדויק של תאים לדור אורגנואיד, אסטרטגיה זו דורשת בחירה נרחבת והקרנה על ידי ניתוח רצף, אשר הוא גם זמן רב ויקר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לצורך התמרה ויראלית יעילה של אורגנואידים מעיים. גישה זו מהירה ויעילה מאוד, ובכך מפחית את הזמן ואת ההוצאות הטמונות בטכנולוגיית CRISPR/Cas9. אנו מציגים גם פרוטוקול כדי ליצור קטעים קפואים מן התרבויות אורגנואיד שלמים לניתוח נוסף עם אימונוהיסטוכימיה או אימונוofluorggogtgggg, אשר יכול לשמש כדי לאשר ביטוי גנים או השתקה. לאחר התמרה מוצלחת של וקטורים ויראליות עבור ביטוי גנים או השתקה מושגת, תא גזע המעיים פונקציה קריפטה ניתן להעריך במהירות. למרות מחקרים אורגנואיד ביותר להעסיק בחוץ מבחנה, אורגנואידים יכול גם להיות מועברת עכברים עבור ניתוחים פונקציונליים vivo. יתר על כן, הגישות שלנו הם יתרון לניבוי תגובות טיפוליות לתרופות, כי כיום הטיפולים הזמינים בדרך כלל פונקציה על ידי ביטוי גנים מודולים או פונקציה חלבון ולא שינוי הגנום.

Introduction

היכולת לעכבר התרבות או האדם קריפטים תאים כתלת מימדי (3D) אורגנואידים מן המעיים או המעי הגס על פני תקופות זמן ממושך סיפק פריצת דרך גדולה כי תרבויות אלה להציג תכונות הגדרת אפיתל המעי ב vivo מיכל בן , מיכל השני , 3. אורגנואידים נגזר הקריפטטים הראשוניים מסוגלים לחידוש עצמי וארגון עצמי, המציגות פונקציות סלולריות דומה לרקמות המקור שלהם. אכן, אורגנואידים לאחר מכן לא רק את הארגון המבני של קריפטים בvivo, אלא גם תכונות מולקולריות רבות, ובכך לספק כלים שימושיים כדי ללמוד ביולוגיה נורמלית מדינות המחלה. כדי להמחיש, מחקרים אורגנואיד חשפו מסלולים מולקולריים מעורבים התחדשות רקמות1,2,3,4,5 כמו גם תרופות שיכולות לשפר את הפונקציה בהגדרות הפתולוגיים6,7.

המחקר של תאי גזע מעיים הוא עניין מיוחד, כי רירית המעיים היא בין רקמות המרגליות הגבוהה ביותר, חידוש עצמו כל 3-5 ימים כדי להגן על האורגניזם מפני חיידקים, רעלים, ופתוגנים אחרים בתוך ה מעיים לומן. תאי גזע מעיים (iscs) אחראים ליכולת הרגנרציה המדהימה הזאת ובכך לספק פרדיגמה ייחודית ללימוד הפונקציה של תא גזע מבוגרים1,2. השושלת-מעקב ניסויים בעכברים הפגינו כי מבודדים Lgr5-חיוביים בתאי גזע יכול להיות מתורבת כדי ליצור אורגנואידים 3D או ‘ מיני מעיים ‘ בתוך מבחנה אשר הם מקרוב מראה שלהם ב vivo עמיתיהם. תרבויות אורגנואיד יכול גם להיות נגזר של תא מעיים קריפטה מבודד מורכב של ושלתי, ISCs, ו Paneth תאים, האחרון אשר מהווים את התאים נישה אפיתל ב vivo. למעשה, תרבות אורגאידית מתאי המעי הראשי בקריפטה התפתחה לתוך טכניקה שגרתית יחסית קל ליישם ברוב המעבדות באמצעות ריאגנטים זמין נרחב. מודל זה הוא גם מקלה לניתוח כמותי של ביטוי גנים על ידי rna-רצף (rna-Seq) וחלבונים על ידי ספקטרומטר המסה, אימונוהיסטוכימיה, או אימונולואוורסטילהכתמים2,4,8. בנוסף, גנטיקה פונקציונלית ניתן ללמוד באמצעות רווח (ביטוי או הבעה גנים של הפעלת גן מוטציה) או אובדן של פונקציה (גנים השתקה או ביטוי של מוטציה אובדן פונקציה) גישות2.

חשוב מכך, יעילות נמוכה ורעילות גבוהה של דנ א סטנדרטי או פרוטוקולים של התמרה ויראלית עם polybrene להישאר משוכה גדולה בתחום. למרות CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מאפשרת עריכת הגנום מדויק, גישה זו דורשת בחירה גוזלת זמן ואחריו אימות רצף9. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגיפי התמרה עבור אורגנואידים המעי הראשי הממוטב מסירה של חלקיקים ויראלי על ידי הקונקטוחלקיקים מגנטיים ויישום של שדה מגנטי. שינויי מפתח לפרוטוקולים קודמים4,5,10, 11,12,13 והמלצות כדי לשפר את היעילות מסופקים. אנו מתארים גם גישה ליצור קטעים קפואים מן האורגנואידים שלמים תרבותי ב-3D מטריצות (המכונה מעתה מטריקס קרום המרתף מטריצה או מטריצה) לניתוח נוסף עם אימונוהיסטוכימיה או אימונוofor, כתמים.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי המוסדות הרפואיים של ג’ונס הופקינס בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC). פרוטוקול זה משתנה משיטות שפורסמו בעבר10,11,12,13. 1. הכנת ריאגנטים הכינו 293T מדיום טרי מספר שעות מראש וחמים 37 ° c באמב…

Representative Results

כאן, אנו מתארים טכניקת התמרה מהירה ויעילה מאוד אשר מרתמות חלקיקים מגנטיים חשופים לשדה מגנטי כדי לספק הנגיף לתאי הריבית. עם כלים זמינים, יש לנו להחיל את הגישה הזאת לא רק כדי לשנות את התאים המבודדים מבודדים בלבד (איור 1A), אלא גם עבור אורגנואידים (א?…

Discussion

התרבות העיקרית של אפיתל המעי הבוגר כמו אורגנואידים מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד מנגנונים מולקולריים מעורב בתפקוד תא גזע, הומאוסטזיס אפיתל המעי, ו פתולוגיה1,2,3, ד. למרות CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה יכולה לשמש מהנדס גנטית אורגנואיד?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), מרילנד תא גזע מחקר קרן (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), האגודה האמריקנית לריאות, רשת הבריאות של אלגני-ג’ונס הופקינס קרן מחקר ומחלות העיכול הופקינס מחקר בסיסי ליבה המחקר מרכז.

Materials

DMEM Thermo Fisher Scientific 11965092 Base medium for 293T cells
DMEM/F12+ Thermo Fisher Scientific 12634010 Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer
OPTI-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 Virus plasmids transfection medium
Fetal Bovine Serum Corning 35-011-CV Component of virus collection medium and 293T medium
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific 15140122 Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer
PBS (without Ca2+, Mg2+) Thermo Fisher Scientific 10010049 A wash buffer and component of crypt dissociation buffer
Mem-NEAA Thermo Fisher Scientific 11140050 Component of organoid culture medium
GlutamaxII Thermo Fisher Scientific 35050061 Component of organoid culture medium
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080 Component of organoid culture medium
EGF Millipore Sigma E9644 Component of organoid culture medium
Noggin Peprotech 250-38 B Component of organoid culture medium
R-spondin R&D 7150-RS-025/CF Component of organoid culture medium
Human recombinant insulin Millipore Sigma I9278-5ml Component of organoid culture medium
Nicotinamide Millipore Sigma N3376-100G Component of Transduction medium
Wnt3A R&D 5036-WN-010 Component of Transduction medium
Y27632 Millipore Sigma Y0503-1MG Component of Transduction medium
0.5M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Component of Crypts dissociation buffer
DTT (dithiothreitol) Thermo Fisher Scientific R0861 Component of Crypts dissociation buffer
Dispase I Millipore Sigma D4818-2MG Component of organoid digestion buffer
DNase I Millipore Sigma 11284932001 Component of organoid digestion buffer
matrigel(Growth factor reduced) Corning 356231 Used as a matrix to embed organoids
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985070 Medium for transfection in viral production
ViralMag R/L Oz Biosiences RL40200 Magnetic particles of viral transduction
Magnetic plate Oz Biosiences MF10000 Magnetic plate to facilitate viral transduction
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019 Transfection agent in viral production
Poly-D-Lysine Millipore Sigma A-003-E Coating for plates before seeding 293T cells
4% Formaldehyde Solution Boster AR1068 Solution to fix organoids
O.C.T embedding compound Thermo Fisher Scientific 4583S For embedding of the the organoids
5 mL Falcon polystyrene tubes Corning 352054
50 mL Falcon Tubes Sarstedt 62.547.100
Orbitron rotator II Rocker Shaker Boekel Scientific 260250
Olympus Inverted microscop CK30 Olympus CK30 for scanning and counting crypts
Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence Nikon Axiovert 200 for viewing fluorescence in the crypts
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane Milipore Sigma UFC910024 For concentrating viruses
pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) pluriSelect SKU 43-50020 For preparing organoid fragments
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 352340 For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) Millipore Sigma M8937-100EA ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments
Animal strain: C57BL/6J Jackson Lab #000664 For organoid culture

References

  1. Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
  2. Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
  5. Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
  6. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  7. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
  8. Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
  9. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
  10. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
  11. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
  12. Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
  15. Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
  16. Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).

Play Video

Cite This Article
Xian, L., Chia, L., Georgess, D., Luo, L., Shuai, S., Ewald, A. J., Resar, L. M. Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning. J. Vis. Exp. (147), e57040, doi:10.3791/57040 (2019).

View Video