Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato
Summary
Descriviamo istruzioni passo-passo a: 1) ingegnerizzare in modo efficiente gli organoidi intestinali utilizzando nanoparticelle magnetiche per la trasduzione lentile o retrovirale e, 2) generare sezioni congelate da organoidi ingegnerizzati. Questo approccio fornisce un potente strumento per modificare in modo efficiente l’espressione genica negli organoidi per lo studio degli effetti a valle.
Abstract
Le colture organoidi intestinali offrono un’opportunità unica per studiare la biologia delle cellule staminali intestinali e della crittografia in vitro, anche se approcci efficienti per manipolare l’espressione genica negli organoidi hanno fatto progressi limitati in questo campo. Mentre la tecnologia CRISPR/Cas9 consente una precisa modifica del genoma delle cellule per la generazione di organiidi, questa strategia richiede un’ampia selezione e screening per analisi di sequenza, che richiede tempo e denaro. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per una trasduzione virale efficiente degli organoidi intestinali. Questo approccio è rapido e altamente efficiente, riducendo così il tempo e le spese inerenti alla tecnologia CRISPR/Cas9. Presentiamo anche un protocollo per generare sezioni congelate da colture organoidi intatte per ulteriori analisi con colorazione immunohistochimica o immunofluorescente, che può essere utilizzata per confermare l’espressione genica o il silenziamento. Dopo aver raggiunto una trasduzione di vettori virali per l’espressione genica o il silenziamento, la funzione delle cellule staminali intestinali e della cripta può essere rapidamente valutata. Anche se la maggior parte degli studi organoidi impiega saggi in vitro, gli organoidi possono anche essere consegnati ai topi per analisi funzionali in vivo. Inoltre, i nostri approcci sono vantaggiosi per prevedere le risposte terapeutiche ai farmaci perché le terapie attualmente disponibili generalmente funzionano modulando l’espressione genica o la funzione proteica piuttosto che alterando il genoma.
Introduction
La capacità di coltura delle cellule di certera umana o di topo come organoidi tridimensionali (3D) dall’intestino tenue o dal colon per periodi di tempo prolungati ha fornito un importante passo avanti perché queste culture mostrano caratteristiche distintive dell’epitelio intestinale in vivo 1 : il nome del , 2 Il nome del sistema , 3. Gli organidi derivati dalle cripte primarie sono in grado di auto-rinnovamento e di auto-organizzazione, che esibiscono funzioni cellulari simili ai loro tessuti di origine. Infatti, gli organoidi riassumono non solo l’organizzazione strutturale delle cripte in vivo, ma anche molte caratteristiche molecolari, fornendo così strumenti utili per studiare i normali stati di biologia e malattia. Per illustrare, studi organoidi hanno rivelato nuovi percorsi molecolari coinvolti nella rigenerazione dei tessuti1,2,3,4,5 così come farmaci che potrebbero migliorare la funzione nelle impostazioni patologiche6,7.
Lo studio delle cellule staminali intestinali è di particolare interesse perché il rivestimento intestinale è tra i tessuti mammiferi più altamente rigenerativi, rinnovandosi ogni 3-5 giorni per proteggere l’organismo da batteri, tossine e altri agenti patogeni all’interno del lumen intestinali. Le cellule staminali intestinali (ISC) sono responsabili di questa notevole capacità rigenerativa e forniscono così un paradigma unico per studiare la funzione delle cellule staminali adulte1,2. Gli esperimenti di tracciamento del lignaggio nei topi hanno dimostrato che le cellule staminali isolate lgr5-positive possono essere coltivate per generare organoidi 3D o “mini-guts” in vitro dove rispecchiano da vicino le loro controparti in vivo. Le colture organoidi possono anche essere derivate da isolati di cellule crittogiformi intestinali costituiti da progenitori, ISC e cellule di Paneth, quest’ultima delle quali costituiscono le cellule di nicchia epiteliali in vivo. Infatti, la coltura organoide dalle cellule primarie della cripta intestinale si è evoluta in una tecnica relativamente di routine che è facile da implementare nella maggior parte dei laboratori utilizzando reagenti ampiamente disponibili. Questo modello è anche suscettibile di analisi quantitativa dell’espressione genica mediante RNA-sequencing (RNA-Seq) e proteine per spettrometria di massa, immunohistochimica o colorazione immunofluorescente2,4,8. Inoltre, la genetica funzionale può essere studiata utilizzando il guadagno di funzione (sopraespressione genica o espressione di un gene mutante attivatore) o la perdita di funzione (silenziamento genico o espressione di un mutante di perdita di funzione) si avvicina2.
È importante sottolineare che la bassa efficienza e l’elevata tossicità del DNA plasmide standard o dei protocolli di trasduzione virale con polibrene rimangono un ostacolo importante nel campo. Sebbene la tecnologia CRISPR/Cas9 consenta un editing preciso del genoma, questo approccio richiede una selezione che richiede molto tempo seguita dalla convalida della sequenza9. Qui presentiamo un protocollo di trasduzione virale per organoidi intestinali primari che ottimizza la consegna di particelle virali mediante coniugazione a nanoparticelle magnetiche e l’applicazione di un campo magnetico. Vengono fornite modifiche chiave ai protocolli precedenti4,5,10,11,12,13 e sono disponibili raccomandazioni per migliorare l’efficienza. Descriviamo anche un approccio per generare sezioni congelate da organoidi intatti coltivati in matrigel 3D (d’ora in poi indicato come matrice della membrana seminterrato o matrice) per ulteriori analisi con immunohistochimica o colorazione immunofluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
La coltura primaria dell’epitelio intestinale adulto come organoidi fornisce un potente strumento per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella funzione delle cellule staminali, l’omeostasi epiteliale intestinale e la patologia1,2,3, 4. Anche se la tecnologia CRISPR/Cas9 può essere utilizzata per ingegnerizzare geneticamente gli organoidi9, è limitata dalla nec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), del Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), dell’American Lung Association, della Allegheny Health Network – Johns Hopkins Research Fund e il Centro di Ricerca di Base sulle Malattie Digestive Hopkins.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
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