Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций
Summary
Мы описываем пошаговые инструкции: 1) эффективно инженер кишечных органоидов с помощью магнитных наночастиц для ленти- или ретровирусной трансдукции, и, 2) генерировать замороженные секции из инженерных органоидов. Этот подход является мощным инструментом для эффективного изменения экспрессии генов в органоидах для исследования эффектов ниже по течению.
Abstract
Кишечные органоидные культуры предоставляют уникальную возможность исследовать кишечные стволовые клетки и биологии склепа in vitro, хотя эффективные подходы к манипулированию экспрессией генов в органоидах добились ограниченного прогресса в этой области. В то время как технология CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать геном клетки для генерации органоидов, эта стратегия требует тщательного отбора и скрининга путем анализа последовательности, что является одновременно трудоемким и дорогостоящим. Здесь мы предоставляем подробный протокол для эффективного вирусного трансдукции кишечных органоидов. Такой подход является быстрым и высокоэффективным, что сокращает время и расходы, присущие технологии CRISPR/Cas9. Мы также представляем протокол для генерации замороженных участков из нетронутых органоидных культур для дальнейшего анализа с иммуногистохимическим или иммунофлуоресцентным окрашиванием, которое может быть использовано для подтверждения экспрессии генов или замалчивания. После успешного трансдукции вирусных векторов экспрессии генов или замалчивания, кишечные стволовые клетки и функции крипты могут быть быстро оценены. Хотя большинство органоидных исследований использовать в пробирке анализы, органоиды также могут быть доставлены мышам для in vivo функциональный анализ. Кроме того, наши подходы являются выгодными для прогнозирования терапевтических реакций на наркотики, потому что в настоящее время доступны терапии обычно функции модуляции экспрессии генов или белковой функции, а не изменения генома.
Introduction
Способность к культуре мыши или человека склепы клеток, как трехмерные (3D) органоидов из тонкого кишечника или толстой кишки в течение длительных периодов времени при условии крупного прорыва, потому что эти культуры отображают определяющие особенности кишечного эпителия in vivo 1 , 2 , 3. Органоиды, полученные из первичных склепов, способны к самообновлению и самоорганизации, демонстрируя клеточные функции, аналогичные их тканям происхождения. Действительно, органоиды резюмируют не только структурную организацию склепов in vivo, но и многие молекулярные особенности, обеспечивая тем самым полезные инструменты для изучения нормальной биологии и состояния болезней. Чтобы проиллюстрировать, органоидные исследования выявилиновые молекулярные пути, участвующие в регенерации тканей 1,2,3,4,5, а также препараты, которые могли бы улучшить функцию в патологическихусловиях 6,7.
Изучение кишечных стволовых клеток представляет особый интерес, поскольку кишечная подкладка является одной из наиболее регенеративных тканей млекопитающих, обновляя себя каждые 3-5 дней, чтобы защитить организм от бактерий, токсинов и других патогенов в кишечные люмены. Кишечные стволовые клетки (ISCs) несут ответственность за эту замечательную регенеративную способность и, таким образом, обеспечивают уникальную парадигму для изучения функции стволовых клеток взрослых1,2. Линейные исследования экспериментов на мышах показали, что изолированные Lgr5-положительные стволовые клетки могут быть культивированы для генерации 3D-органоидов или «мини-кишки» в пробирке, где они тесно отражают свои аналоги in vivo. Органоидные культуры также могут быть получены из изолятов клеток кишечных склепов, состоящих из прародителей, МЦКов и клеток Панета, последние из которых составляют эпителиальные нишевые клетки in vivo. На самом деле, органоидная культура из первичных клеток кишечного склепа превратилась в относительно рутинную технику, которую легко реализовать в большинстве лабораторий с использованием широко доступных реагентов. Эта модель также поддается количественному анализу экспрессии генов с помощью РНК-секвенирования (РНК-Сек) и белков масс-спектрометрией, иммуногистохимией или иммунофлуоресцентным окрашиванием2,4,8. Кроме того, функциональная генетика может быть изучена с помощью усиления функции (переэкспрессия гена или экспрессии активирующего мутантного гена) или потери функции (заглушение гена или экспрессия мутанта потери функции) приближаетсяк2.
Важно отметить, что низкая эффективность и высокая токсичность стандартной плазмидной ДНК или вирусных протоколов трансдукции с полибреном остаются основным препятствием в этой области. Хотя технология CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать геном, этот подход требует многовремени выбора с последующим проверкой последовательности9. Здесь мы представляем протокол вирусной трансдукции для первичных кишечных органоидов, который оптимизирует доставку вирусных частиц путем спряжения к магнитным наночастицам и применения магнитного поля. Приводятся ключевые измененияв предыдущие протоколы 4,5,10,11,12,13 и рекомендации по повышению эффективности. Мы также описываем подход к созданию замороженных секций из нетронутых органоидов, культивированных в 3D матригель (отсюда называют подвал мембранной матрицы или матрицы) для дальнейшего анализа с иммуногистохимии или иммунофлуоресцентного окрашивания.
Protocol
Representative Results
Discussion
Первичная культура эпителия кишечника у взрослых в качестве органоидов обеспечивает мощный инструмент для изучения молекулярных механизмов, участвующих в функции стволовых клеток, эпителиального гомеостаза кишечника и патологии1,2,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами От Национального института здравоохранения (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Мэриленд Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), Американской ассоциации легких, Allegheny Health Network – Johns Научно-исследовательский фонд Хопкинса и Центр основных исследований в области заболеваний пищеварения Хопкинса.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
