Genteknik för primär mus intestinal Organoider med hjälp av magnetiska nanopartikel Transduction virala vektorer för frysta snittning
Summary
Vi beskriver steg-för-steg-instruktioner för att: 1) effektivt iscensätta intestinala organoider med hjälp av magnetiska nanopartiklar för lenti-eller antiretrovirala transduktion, och, 2) generera frysta sektioner från konstruerade organoider. Detta tillvägagångssätt ger ett kraftfullt verktyg för att effektivt förändra genuttryck i organoider för utredning av nedströms effekter.
Abstract
Intestinala Organoid kulturer ger en unik möjlighet att undersöka intestinal stamceller och crypt biologi in vitro, även om effektiva metoder för att manipulera genuttryck i organoider har gjort begränsade framsteg på denna Arena. Medan CRISPR/Cas9 teknik möjliggör exakt genom redigering av celler för Organoid generation, kräver denna strategi omfattande urval och screening av sekvens analys, vilket är både tidskrävande och kostsamt. Här ger vi ett detaljerat protokoll för effektiv viral transduktion av intestinala organoider. Denna metod är snabb och mycket effektiv, vilket minskar den tid och kostnader som är förknippade med CRISPR/Cas9 teknik. Vi presenterar också ett protokoll för att generera frysta sektioner från intakt Organoid kulturer för vidare analys med immunohistokemisk eller Immunofluorescerande färgning, som kan användas för att bekräfta genuttryck eller ljuddämpning. Efter lyckad transduktion av virala vektorer för genuttryck eller ljuddämpning uppnås, kan intestinal Stem cell och crypt funktion snabbt bedömas. Även om de flesta Organoid studier använder in vitro-analyser, kan organoider också levereras till möss för in vivo funktionella analyser. Dessutom, våra metoder är fördelaktiga för att förutsäga terapeutiska svar på läkemedel eftersom närvarande tillgängliga terapier i allmänhet fungerar genom att modulera genuttryck eller proteinfunktion snarare än att förändra genomet.
Introduction
Förmågan att odla mus eller mänskliga kryptor celler som tredimensionell (3D) organoider från tunntarmen eller tjocktarmen under längre tidsperioder som ett stort genombrott eftersom dessa kulturer Visa definierande egenskaper av intestinal epitel in vivo 1 , 2 , 3. organoider som härrör från primära kryptor kan själv förnyas och självorganisering, uppvisar cellulära funktioner som liknar deras vävnader av ursprung. Faktum organoider recapitulate inte bara strukturell organisation av kryptor in vivo, men också många molekylära funktioner, vilket ger användbara verktyg för att studera normal biologi och sjukdomstillstånd. För att illustrera, Organoid studier har avslöjat nya molekylära vägar involverade i vävnadsregenerering1,2,3,4,5 samt läkemedel som kan förbättra funktionen i patologisk inställningar6,7.
Studiet av tarm stamceller är av särskilt intresse eftersom tarmslemhinnan är bland de mest regenerativa däggdjursvävnader, förnya sig varje 3-5 dagar för att skydda organismen från bakterier, toxiner och andra patogener inom tarm lumen. Intestinala stamceller (iSCS) är ansvariga för denna anmärkningsvärda regenerativ förmåga och därmed ge en unik paradigm för att studera vuxna stamceller funktion1,2. Försök med härstamnings spårning hos möss visade att isolerade Lgr5-positiva stamceller kan odlas för att generera 3D-organoider eller “mini-Guts” in vitro där de nära speglar deras in vivo motsvarigheter. Organoid kulturer kan också härledas från intestinal crypt cell isolat består av progenitorer, ISCs, och Paneth celler, den senare som utgör epiteliala nisch celler in vivo. I själva verket, Organoid kultur från primära tarm kryptan celler har utvecklats till en relativt rutinmässig teknik som är lätt att genomföra i de flesta laboratorier med allmänt tillgängliga reagenser. Denna modell är också mottaglig för kvantitativ analys av genuttryck genom RNA-sekvensering (RNA-SEQ) och proteiner med masspektrometri, immunohistokemi, eller Immunofluorescerande färgning2,4,8. Dessutom kan funktionell genetik studeras med hjälp av Gain-of-funktion (genöveruttryck eller uttryck för en aktiverande mutantgen) eller förlust-av-funktion (gen ljuddämpning eller uttryck för en förlust-av-funktion Mutant) närmar2.
Viktigt, låg verkningsgrad och hög toxicitet av standard plasmid DNA eller viral signaltransduktion protokoll med polybrene förbli ett stort hinder i området. Även om CRISPR/Cas9-tekniken möjliggör exakt genom redigering, kräver denna metod tidskrävande val följt av sekvensvalidering9. Här presenterar vi en viral signaltransduktion protokoll för primära intestinala organoider som optimerar leveransen av virala partiklar genom konjugering till magnetiska nanopartiklar och tillämpning av ett magnetfält. Viktiga ändringar av tidigare protokoll4,5,10,11,12,13 och rekommendationer för att öka effektiviteten tillhandahålls. Vi beskriver också en metod för att generera frysta sektioner från intakta organoider odlade i 3D-matrigel (hädanefter kallad basalmembran Matrix eller Matrix) för vidare analys med immunohistokemi eller Immunofluorescerande färgning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primär kultur av vuxna intestinal epitel som organoider ger ett kraftfullt verktyg för att studera molekylära mekanismer som är involverade i stamcells funktion, intestinal epitelial homeostas, och patologi1,2,3, 4. Även om CRISPR/Cas9 teknik kan användas för att genetiskt iscensätta organoider9, är det begränsat av behovet av omfattande screening och urval ba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland stamcells forskningsfond (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), American lung Association, den Allegheny Health Network-Johns Hopkins forskningsfond och Hopkins matsmältningsorganen grundforskning kärna centrum.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
