Amplificazione isotermica multiplex basato su piattaforma diagnostica per rilevare Zika, Chikungunya e Dengue 1
Summary
Corrente multiplexed diagnostica per rilevare virus dengue, chikungunya e Zika richiedono preparazione campioni complessi e costosi strumentazione e sono difficili da utilizzare in ambienti di risorse in esaurimento. Vi mostriamo una diagnostica che utilizza amplificazione isotermica con sonde displaceable strand mirate per rilevare e distinguere questi virus con alta sensibilità e specificità.
Abstract
Zika, dengue e chikungunya virus vengono trasmessi dalle zanzare, che causano malattie con sintomi simili del paziente. Tuttavia, hanno potenzialità di trasmissione paziente–paziente a valle diversi e richiedono trattamenti pazienti molto diversi. Così, recenti focolai di Zika rendono urgente di sviluppare strumenti che discriminano rapidamente questi virus in pazienti e intrappolato le zanzare, per selezionare il corretto trattamento del paziente e per comprendere e gestire la loro epidemiologia in tempo reale.
Purtroppo, attuale test diagnostici, tra cui quelli emergenza 2016 ricevente utilizzare autorizzazioni e fast track stato, rilevare RNA virale da reazione a catena della polimerasi d’inversione della trascrizione (RT-PCR), che richiede strumentazione, addestrato gli utenti, e preparazione del campione considerevole. Così, essi devono essere inoltrati ai laboratori di riferimento “approvato”, che richiede tempo. Infatti, in agosto 2016, il Center for Disease Control (CDC) stava chiedendo donne incinte che era stato morso da una zanzara e ha sviluppato un’eruzione che indica Zika aspettare un’inaccettabile 2 a 4 settimane prima di imparare se sono stati infettati. Abbiamo molto bisogno di test che può essere fatto sul posto, con poche risorse e da personale addestrato ma non necessariamente con licenza.
Questo video dimostra un’analisi che soddisfa queste specifiche, lavorando con urina o siero (per pazienti) o carcasse di zanzara schiacciata (per sorveglianza ambientale), tutto senza molta preparazione del campione. Carcasse di zanzara vengono catturate su carta che trasportano gruppi ammonio quaternario (Q-carta) seguite da trattamento con ammoniaca per gestire rischi biologici. Questi sono quindi direttamente, senza isolamento del RNA, messi in provette contenenti i reagenti liofilizzati che hanno bisogno di nessuna catena di refrigerazione. Una forma modificata di trascrizione d’inversione ciclo-amplificazione isotermica mediata da con mirate fluorescente contrassegnati spostabile sonde produce della lettura, in 30 min, come un segnale di fluorescenza in tre colori. Questo viene visualizzato con un dispositivo palmare, alimentato a batteria con un filtro arancione. Contaminazione di avanti è evitata con provette sigillate e l’uso di uracile termolabile DNA glicosilasi (UDG) in presenza di dUTP nella miscela di amplificazione.
Introduction
Le infezioni virali trasmesse dalle zanzare, incluse dengue e chikungunya virus di Zika sono sulle strategie di gestione immediata ascesa e la domanda. Dengue e chikungunya virus sono già endemico in molte regioni tropicali dove Zika sta ormai dilagando in emisfero occidentale1. Virus di Zika, come dengue, è un membro della famiglia Flaviviridae ed è originario dell’Africa con una asiatica e due stirpi genetici africano2. Anche se l’identificazione del virus Zika risale al 1947, Zika infezione in esseri umani è rimasto sporadico per mezzo secolo prima di emergere nel Pacifico e nelle Americhe. Il primo focolaio segnalato di Zika febbre si è verificato su Isola di Yap, Stati federati di Micronesia nel 2007, seguita da Polinesia francese nel 2013 e nel 2014. Il primo focolaio principale nelle Americhe si è verificato nel 2015 in Brasile.
I virus di Zika, chikungunya e dengue sono principalmente trasmessi da Aedes aegypti e Aedes albopictus. Tuttavia, Zika ha trasmissione umano–umana a valle ulteriori possibilità, probabilmente viene diffuso attraverso il contatto sessuale, l’interazione madre-di-feto e tramite l’allattamento3,4,5. Zika febbre prima credeva di causare una malattia solo lieve. Tuttavia, fu più tardi associato con la sindrome di Guillain-Barré in adulti, microcefalia in neonati e malattie del sistema muscoloscheletrico cronici che possono durare mesi e anni. Diagnosi di malattia di Zika può essere difficile, poiché i sintomi di un’infezione di Zika sono simili a quelli di altri di zanzara-diffondere virus6. Co-infezioni comuni di questi virus fanno diagnosi differenziale ancora più impegnativo7,8. Pertanto, rilevazione rapida e affidabile degli acidi nucleici da Zika e altri virus è necessario per comprendere l’epidemiologia in tempo reale, per avviare il controllo e le misure preventive e di gestire la cura paziente9.
Test diagnostici correnti per questi virus includono analisi sierologiche, isolamento del virus, sequenziamento del virus e PCR d’inversione-trascrizione (RT-PCR). Gli approcci sierologici standard spesso soffrono di sensibilità inadeguata e risultati possono essere complicati da reattività crociata in pazienti che sono stati infettati in precedenza da altri flavivirus.
Di conseguenza, degli acidi nucleici testing rimane il modo più affidabile per rilevare e distinguere questi virus. Rilevamento di Zika e altri virus zanzara è di solito eseguita mediante RT-PCR o RT-PCR in tempo reale in varietà di fluidi biologici, come siero, urina, saliva, sperma, latte materno e fluido cerebrale10,11. Campioni di urina e saliva sono generalmente preferiti sopra anima, poiché esibiscono meno PCR-inibizione, più alti carichi virali, presenza di virus per lunghi periodi di tempo e una maggiore facilità di raccolta e gestione delle12,13. Test diagnostici basati su RT-PCR, tuttavia, comprendere la procedura di preparazione del campione vasto e costose attrezzature ciclismo termica, rendendolo meno ottimale per il point-of-care.
Retrotrascrizione amplificazione isotermica mediata da loop (RT-LAMP) è emerso come una potente alternativa di RT-PCR, grazie alla sua elevata sensibilità e specificità14,15, campioni di relativa tolleranza per sostanze inibitorie in biologico e operazione singola temperatura, che significativamente si abbassa tenore complessità e costi associati, che lo rende adatto per ambienti di risorse in esaurimento. RT-LAMP, come classicamente è implementato, comprende sei iniettori che si legano a otto regioni distinte all’interno del RNA dell’obiettivo. Funziona a temperature costanti tra 60 ° C e 70 ° C e utilizza una trascrittasi inversa e una polimerasi del DNA con filo forte spostando attività.
Durante le fasi iniziali di RT-LAMP, avanti e indietro interni iniettori (FIP e BIP, Figura 1A) con primer esterno avanti e indietro (F3 e B3) formano una struttura con manubri, la struttura di seme di amplificazione esponenziale di lampada. Amplificazione è ulteriormente accelerato tramite i ciclo avanti e indietro gli iniettori (LF e LB), che sono progettati per associare le singole regioni non recuperabili di dumbbell, e risultati nella formazione di concatemeri con ripetere più cicli16. LAMPADA classica analisi basata su torbidità o lettura di DNA intercalanti coloranti non è completamente adatta per rilevazione di point-of-care di Zika, dove un certo livello di multiplazione è voluto17,18,19. Multiplexing non è facilmente ottenuti in questi sistemi, come sono inclini a generare falsi positivi a causa di amplificazioni fuori bersaglio.
Per gestire questi problemi, la letteratura aggiunge un componente supplementare sotto forma di una “filo-spostando la sonda” il21,20,di architettura classica RT-LAMP22. Ogni sonda è una regione del doppio filamento di sequenza-specifico e una regione di adescamento singolo filamento. La sonda con la regione di singolo filamento è etichettata con un fluoroforo 5′ e la sonda complementare viene modificata con un quencher estremità 3′. In assenza di un obiettivo, fluorescenza non è osservata a causa di ibridazione dei fili sonda complementare, che porta il fluoroforo e quencher in stretta vicinanza. In presenza di un bersaglio, la porzione di filamento singolo della sonda fluorescente si lega al suo complementare sul bersaglio e viene quindi esteso da un filamento spostando della polimerasi. Ulteriore estensione della polimerasi di iniettori d’inversione provoca la separazione del filo del quencher dal suo filone fluorescente contrassegnati complementari, consentendo l’emissione di fluorescenza (Figura 1B). Con questo disegno, il segnale viene generato dopo la formazione di dumbbell, riducendo le possibilità di falsi positivi segnali.
La parte di double-stranded della sonda strand-spostando può essere qualsiasi sequenza, e quando viene applicato il multiplexing, la stessa sequenza può essere utilizzata con coppie diverse fluorophore-quencher. Con questa architettura, contaminati dal virus dell’urina, siero o zanzara campioni schiacciati sulla carta sono stati introdotti direttamente il dosaggio senza preparazione del campione. Letture di tre colori di fluorescenza visibile all’occhio umano sono stati generati all’interno di 30-45 min, e i segnali sono stati visualizzati da una finestra di osservazione 3D-stampato che utilizza un LED blu e un filtro arancione. Liofilizzazione i reagenti RT-LAMP attivata la distribuzione di questo kit per abbassare le impostazioni delle risorse senza la necessità di refrigerazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zanzara virus compreso Zika, chikungunya e dengue minacciano la salute pubblica ed evidenziazione di focolai Zika risale la necessità di alternative di rilevazione di point-of-care di basso costo per la diagnostica del paziente, nonché per la sorveglianza di zanzara. Come alternative a prezzi accessibili ai sistemi basati su PCR sono stati sviluppati metodi di amplificazione isotermica. In particolare, sono state applicate piattaforme basate su RT-lampada per rilevare un’ampia gamma di agenti patogeni. Tuttavia, l’uso …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto in parte da FDOH-7ZK15 e NIAID 1R21AI128188-01. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta in parte dal National Institutes of Allergy e malattie infettive e in parte da Biomedical Research programma di Florida Department of Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH o Florida Department of Health. LLC di chimica combinatoria dinamico è riconosciuto per il loro sostegno e contributo a questo progetto.
Virus di febbre rompiossa 1 (ceppo BOL-KW010) è stato gentilmente fornito dal dipartimento di Florida salute Bureau dei laboratori. Virus di Zika e variante asiatica del virus chikungunya sono stati gentilmente forniti dai centri per controllo e la prevenzione. Il lignaggio di oceano indiano di chikungunya virus era gentilmente fornito da Robert Tesh (centro di riferimento mondiale per virus d’emersione e gli arbovirus, attraverso l’Università del Texas Medical Branch a Galveston, in Texas) per l’UF-FMEL. Ringraziamo S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, ZimLer r. e K. Zirbel per assistenza con gli studi di infezione. Ringraziamo anche M. S. Kim per la fornitura di Q-carta.
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
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