متعدد التضخيم متحاور على أساس منهاج التشخيصية للكشف عن زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك 1
Summary
الحالي متعدد التشخيص للكشف عن زيكا، الشيكونغونيا، وفيروسات حمى الضنك تتطلب إعداد نماذج معقدة ومكلفة للأجهزة، وهي صعبة الاستخدام في البيئات قليلة الموارد. علينا إظهار تشخيص التي يستخدمها التضخيم متحاور مع تحقيقات منقولة حبلا محددة الهدف لكشف والتفريق بين هذه الفيروسات مع حساسية عالية وخصوصية.
Abstract
زيكا وحمى الضنك وداء شيكونغونيا الفيروسات تنتقل عن طريق البعوض، تسبب الأمراض مع أعراض المريض مشابهة. ومع ذلك، لديها إمكانات نقل مريض للمتلقين للمعلومات المختلفة، وتتطلب علاجات المريض مختلفة جداً. وهكذا، تفشي Zika مؤخرا تجعل من الملح على تطوير الأدوات التي تميز سرعة هذه الفيروسات في المرضى والمحاصرين البعوض، لتحديد علاج المريض الصحيح، وفهم وإدارة تلك الأوبئة في الوقت الحقيقي.
للأسف، الاختبارات التشخيصية الحالية، بما في ذلك تلك الطوارئ 2016 المستقبلة استخدام أذون والسريع حالة، كشف الجيش الملكي النيبالي الفيروسية بالنسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR)، الأمر الذي يتطلب أجهزة القياس، تدريب المستخدمين، و إعداد عينة كبيرة. وهكذا، يجب أن ترسل إلى مختبرات مرجعية “المعتمدة”، التي تحتاج إلى وقت. وفي الواقع، في آب/أغسطس عام 2016، المركز لمراقبة الأمراض كان يسأل النساء الحوامل الذين كان عضات البعوض ووضع طفح جلدي تشير إلى Zika الانتظار أمر غير مقبول من 2 إلى 4 أسابيع قبل التعلم ما إذا كانوا مصابين. نحن بحاجة إلى الاختبارات التي يمكن القيام به في الموقع، مع القليل من الموارد والأفراد المدربين ولكن ليس بالضرورة مرخصة كثيرا جداً.
ويوضح هذا الفيديو مقايسة يفي بتلك المواصفات، وتعمل مع البول أو المصل (بالنسبة للمرضى) أو ذبائح سحق البعوض (للمراقبة البيئية)، كل ذلك دون إعداد عينة كثيرا. يتم التقاط جثث البعوض على ورقة تحمل رباعي الأمونيوم المجموعات (س-الورق) تليها المعاملة الأمونيا لإدارة ندركها. هذه بعد ذلك مباشرة، دون عزل الحمض النووي الريبي، توضع في أنابيب المقايسة تتضمن المعصوفه الكواشف التي تحتاج إلى لا سلسلة التبريد. وتنتج صيغة معدلة من النسخ العكسي بوساطة حلقة التضخيم متحاور مع تحقيقات منقولة فلوريسسينتلي كلمات محددة الهدف قراءات، في 30 دقيقة، كإشارة fluorescence ألوان. وهذا هو تصور مع جهاز محمول باليد، والبطارية مع عامل تصفية اللون برتقالي. يتم منع التلوث إلى الأمام مع أنابيب مختومة، واستعمال اليوراسيل ثيرمولابيلي DNA glycosylase (UDG) حضور dUTP في خليط التضخيم.
Introduction
إصابات الفيروسات المنقولة بالبعوض، بما في ذلك حمى الضنك وداء شيكونغونيا وفيروسات Zika على استراتيجيات الإدارة الفورية الارتفاع والطلب. فيروسات حمى الضنك وداء شيكونغونيا بالفعل المستوطنة في كثير من المناطق المدارية حيث ينتشر الآن Zika في نصف الكرة الغربي1. فيروس زكى، مثل حمى الضنك، أحد أفراد عائلة فيروسات مصفرة والأصلية لأفريقيا مع آسيا واحد واثنين من السلالات الجينية الأفريقية2. على الرغم من أن تحديد هوية الفيروس Zika يعود تاريخها إلى عام 1947، ما زالت العدوى Zika في البشر متفرقة لنصف قرن قبل الناشئة في منطقة المحيط الهادئ والأمريكتين. أول اندلاع المبلغ عنها من Zika حمى وقع في جزيرة ياب في ولايات ميكرونيزيا الموحدة في عام 2007، تليها بولينيزيا الفرنسية في عام 2013 و 2014. حدث اندلاع الرئيسية الأولى في الأمريكتين بحلول عام 2015 في البرازيل.
فيروسات زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك تنتقل أساسا Aedes albopictusو بعوض الزاعجة المصرية . ومع ذلك، قد Zika إمكانيات إضافية انتقال البشر إلى المصب، المحتمل أن ينتشر عن طريق الاتصال الجنسي، وتفاعل الأم إلى الجنين، وعن طريق الرضاعة الطبيعية3،،من45. ويعتقد حمى زيكا أولاً تسبب المرض خفيفة فقط. بيد أنه في وقت لاحق المرتبطة بمتلازمة غيلان باريه في البالغين، وصغر الرأس في المواليد الجدد، والأمراض العضلية الهيكلية المزمنة التي قد الأشهر الأخيرة لسنوات. يمكن أن يكون تحديا تشخيص المرض Zika، نظراً لأعراض عدوى Zika مماثلة لتلك التي ل انتشار البعوض فيروسات أخرى6. الالتهابات المشارك المشتركة من هذه الفيروسات تجعل تشخيص تفاضلية أكثر تحديا7،8. ولذلك، مطلوب الكشف السريع والموثوق بها من الأحماض النووية من Zika وغيره من الفيروسات لفهم وبائيات في الوقت الحقيقي، والشروع في المراقبة، والتدابير الوقائية، وإدارة رعاية المرضى9.
وتشمل الاختبارات التشخيصية الحالية لهذه الفيروسات PCR النسخ العكسي (RT-PCR) وتسلسل الفيروس، الاختبارات المصلية وعزل الفيروس. النهج المصلية القياسية غالباً ما يعانون من حساسية غير كافية والنتائج يمكن أن تكون تعقدت ه في المرضى الذين أصيبوا سابقا بأخرى فلافيفيروسيس.
ولذلك، اختبار الحمض النووي يظل الطريقة الأكثر موثوقية لكشف والتفريق بين هذه الفيروسات. عادة ما يتم إجراء الكشف عن زيكا وغيره من الفيروسات المنقولة بالبعوض باستخدام الرايت-بكر أو RT-PCR الوقت الحقيقي في مجموعة متنوعة من السوائل البيولوجية، مثل مصل الدم والبول واللعاب، السائل المنوي، وحليب الثدي و السائل الدماغي10،11. عينات البول واللعاب المفضل عموما عبر الدم، حيث أنها تظهر أقل PCR-تثبيط، أعلى الأحمال الفيروسية، وجود الفيروس لفترات أطول من الوقت، وزيادة سهولة جمع ومعالجة12،13. ومع ذلك، تشمل الرايت-بكر-تعتمد الاختبارات التشخيصية، خطوات إعداد عينة واسعة ومكلفة معدات الدراجات الحرارية، يجعلها أقل الأمثل للنقطة من الرعاية.
عكس النسخ بوساطة حلقة التضخيم متحاور (RT-مصباح) برز كبديل RT-PCR قوية نظراً لحساسية عالية وخصوصية14، التسامح للمواد المثبطة في البيولوجية عينات15، و العملية في درجة حرارة واحدة، والتي إلى حد كبير يخفض الاعتداء التعقيد والتكاليف المرتبطة بها، يجعلها مناسبة للبيئات قليلة الموارد. RT-مصباح، كما أنه ينفذ تقليديا، تضم ستة أجهزة الإشعال التي تربط إلى ثماني مناطق متميزة ضمن هدف الجيش الملكي النيبالي. أنه يعمل في درجات حرارة ثابتة بين 60 و 70 درجة مئوية، ويستخدم المنتسخة العكسية وبوليميراز الدنا مع حبلا قويا مما أدى إلى تشريد النشاط.
أثناء المراحل الأولية من مصباح RT، الإشعال الداخلية إلى الأمام والخلف (FIP والمقاضاة، الشكل 1A) جنبا إلى جنب مع الإشعال إلى الأمام والخلف الخارجي (F3 و B3) تشكيل هيكل دمبل، هيكل البذور من الأسى مصباح التضخيم. التضخيم هو كذلك عجلت بها حلقة إلى الأمام والخلف الإشعال (LF ورطل)، التي تهدف إلى ربط مناطق واحد الذين تقطعت بهم السبل الدمبل، والنتائج في تشكيل كونكاتيميرس مع تكرار متعددة الحلقات16. مصباح الكلاسيكية فحوصات التعكر على أساس أو قراءات من الحمض النووي إينتيركالاتينج الأصباغ ليست ملائمة تماما للكشف عن نقطة من الرعاية من زكى، حيث يكون مستوى معين من الإرسال المتعدد المطلوب17،18،19. الإرسال المتعدد هو عدم الحصول عليها بسهولة في هذه النظم، كما أنها عرضه لتوليد إيجابيات كاذبة بسبب إيضاحات مسهبة خارج الهدف.
لإدارة هذه المسائل، يضيف الأدب عنصر إضافي في شكل “المسبار مما أدى إلى تشريد حبلا” إلى الكلاسيكية RT-مصباح العمارة20،،من2122. كل مسبار بمنطقة ستراند المزدوجة الخاصة بتسلسل ومنطقة فتيلة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل. هو معلم التحقيق مع منطقة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل مع 5 ‘–فلوروفوري، وهو تعديل التحقيق التكميلية مع يحتوي 3’ في نهاية. نظراً لغياب الهدف، يلاحظ لا الأسفار بسبب تهجين خيوط التحقيق التكميلي، الذي يجمع فلوروفوري وتقضي إلى مقربة. حضور هدفا، جزء واحد-الذين تقطعت بهم السبل في التحقيق الفلورسنت يربط إلى مجموعتها على الهدف، ومن ثم مددت حبلا مما أدى إلى تشريد بوليميريز. تمديد بوليميريز بعكس كبسولة تفجير يسبب فصل حبلا يحتوي من به حبلا المسمى فلوريسسينتلي تكميلية، السماح لانبعاثات الأسفار (1B الشكل). مع هذا التصميم، يتم إنشاء الإشارة بعد تشكيل الدمبل، تقليل فرص إشارات إيجابية كاذبة.
يمكن جزء مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في التحقيق مما أدى إلى تشريد حبلا أي تسلسل، وعندما يتم تطبيق الإرسال المتعدد، يمكن استخدام نفس تسلسل مع أزواج يحتوي فلوروفوري مختلفة. مع هذا الهندسة المعمارية أو البول الملوث بالفيروس أو المصل أو البعوض أدخلت عينات مسحوق على الورق مباشرة للمقايسة دون تحضير العينة. Read-outs fluorescence ألوان مرئياً للعين البشرية تم إنشاؤها ضمن 30-45 دقيقة، وكانت تصور إشارات بمربع طباعة 3D مراقبة التي تستخدم الصمام أزرق وعامل تصفية اللون برتقالي. التجميد الكواشف RT-مصباح تمكين نشر هذه المجموعة على خفض إعدادات المورد دون حاجة للتبريد.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفيروسات المنقولة بالبعوض، بما في ذلك زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك تهدد الصحة العامة وتسليط الضوء على حالات تفشي Zika الأخيرة الحاجة إلى بدائل منخفضة التكلفة نقطة العناية بالكشف لتشخيص المريض، فضلا عن مراقبة البعوض. وقد وضعت أساليب التضخيم متحاور كبدائل ميسورة للأنظمة المستندة إلى PCR. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد العمل في جزء 7ZK15 فدوة ونييد 1R21AI128188-01. كان يؤيد البحث عنها في هذا المنشور في الجزء “المعاهد الوطنية للحساسية” و “الأمراض المعدية”، وجزئياً “الطب الحيوي البحث البرنامج من فلوريدا وزارة الصحة”. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو وزارة الصحة ولاية فلوريدا. شركة الكيمياء التوافيقيه دينامية المسلم لدعمها ومساهمتها في هذا المشروع.
وكان فيروس حمى الضنك 1 (سلالة BOL-KW010) يرجى المقدمة “إدارة ولاية فلوريدا من مكتب الصحة” المختبرات. فيروس Zika وسلالته الآسيوية من فيروس الشيكونغونيا قدمت مشكورا المراكز للسيطرة على الأمراض والوقاية. يرجى قدم النسب المحيط الهندي من فيروس الشيكونغونيا روبرت تيش (مركز الإحالة العالم بحثاً عن الفيروسات الناشئة وسيتناقش، من خلال فرع جامعة تكساس الطبية في غالفيستون، تكساس) إلى الجبهة المتحدة-فميل. ونشكر س. بيلامي، ابستموند ب، س. أورتيز، فيليز دال، يغينز ك.، زيملير ر. وزيربيل ك. للمساعدة في دراسات عدوى. ونشكر أيضا م. س. كيم لتقديم الورقة Q.
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
References
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -. Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
- Gourinat, A. C., O’Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
- Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , (2016).
