Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1
Summary
Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.
Abstract
Zika, Dengue-Fieber und Chikungunya-Fieber-Viren werden durch Mücken, übertragen Krankheiten mit ähnlichen Symptomen der Patienten verursachen. Jedoch haben andere nachgeschaltete Patient zu Patient Übertragung Potentiale, und erfordern sehr unterschiedliche Patienten Behandlungen. So Zika Ausbrüchen machen es dringend notwendig, Werkzeuge zu entwickeln, die diese Viren bei Patienten schnell zu diskriminieren und Mücken, um die richtige Behandlung von Patienten, wählen und verstehen und verwalten ihre Epidemiologie in Echtzeit gefangen.
Leider aktuellen diagnostischen Tests, einschließlich die empfangende 2016 Notfall verwenden Berechtigungen und Fast-Track-Status, virale RNA durch reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), die Instrumentierung erfordert, geschulte Benutzer, zu erkennen und beträchtliche Probenvorbereitung. So müssen sie “genehmigt” Referenzlaboratorien, die Zeit gesendet werden. In der Tat im August 2016, das Center for Disease Control (CDC) fragte schwangere Frauen gewesen, die von einer Mücke gebissen und entwickelte einen Zika-Angabe Hautausschlag, eine inakzeptable 2 bis 4 Wochen vor dem Lernen zu warten, ob sie infiziert sind. Wir brauchen sehr viel Tests, die vor Ort, mit wenigen Mitteln und durch ausgebildete, aber nicht notwendigerweise lizenzierte Personal erfolgen können.
Dieses Video zeigt einen Test, der diese Spezifikationen, arbeiten mit Urin oder Serum (für Patienten) oder zerdrückten Mücken Kadaver (für Umweltüberwachung), alles ohne viel Vorbereitung der Probe. Mosquito Schlachtkörper werden auf Papier mit quaternären Ammonium Gruppen (Q-Papier) gefolgt von Ammoniak Behandlung um Biogefährdung verwalten erfasst. Diese sind dann direkt, ohne eine RNA-Isolierung, legen in Assay-Röhrchen mit gefriergetrockneten Reagenzien, die keine Kette der Kühlung benötigen. Eine modifizierte Form der reversen Transkription Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Eindringmittel tagged verschieblich Sonden produziert auslesen, in 30 min, als eine dreifarbige Fluoreszenzsignal. Dies ist mit einem handheld, batteriebetriebenes Gerät mit einen Orangefilter visualisiert. Nach vorne Kontamination wird mit versiegelten Röhren und die Verwendung von thermolabilen Uracil DNA Glycosylase (UDG) in Anwesenheit von dUTP in der Verstärkung Mischung verhindert.
Introduction
Moskitos übertragene Virus-Infektionen, einschließlich Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika Viren sind auf den Aufstieg und Nachfrage sofortige Managementstrategien. Dengue-Fieber und Chikungunya-Fieber-Viren sind bereits in vielen tropischen Regionen denen Zika jetzt in der westlichen Hemisphäre1verbreitet ist endemisch. Zika-Virus, wie Dengue-Fieber, ist ein Mitglied der Familie Flaviviridae und stammt aus Afrika mit einem asiatischen und zwei afrikanische genetische Linien2. Obwohl die Identifizierung des Virus Zika bis 1947 zurückgeht, blieb Zika-Infektion beim Menschen sporadisch für ein halbes Jahrhundert vor der Schwellenländer in den Pazifik und Amerika. Der erste gemeldete Ausbruch der Zika-Fieber auf der Insel Yap in den Föderierten Staaten von Mikronesien im Jahr 2007 trat gefolgt von Französisch-Polynesien in 2013 und 2014. Der erste große Ausbruch auf dem amerikanischen Kontinent ereignete sich im Jahr 2015 in Brasilien.
Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber-Viren sind in erster Linie von Aedes Aegypti und Aedes Albopictusübertragen. Zika hat jedoch zusätzliche nachgeschaltete Mensch-zu-Mensch-Übertragungsmöglichkeiten, wahrscheinlich, zu verbreiten, durch sexuellen Kontakt, Mutter-Fötus-Interaktion, und über3,4,5stillen. Zika Fieber glaubte zunächst nur milde Krankheit verursachen. Jedoch wurde es später im Zusammenhang mit Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen, Mikrozephalie bei Neugeborenen und chronischen Erkrankungen des Bewegungsapparates, die letzten Monate bis Jahre. Zika Erkrankung kann schwierig sein, da die Symptome einer Zika-Infektion ähnlich denen von anderen Mücke verbreitete Viren-6 sind. Allgemeine Coinfektion dieser Viren machen Differentialdiagnose noch schwieriger7,8. Daher braucht man schnelle und zuverlässige Detektion von Nukleinsäuren von Zika und andere Viren Epidemiologie in Echtzeit, um Kontrolle und vorbeugende Maßnahmen zu initiieren und Patientenversorgung9verwalten zu verstehen.
Aktuelle diagnostische Tests für diese Viren sind serologische Tests, die Virusisolierung, Virus-Sequenzierung und Reverse Transkription PCR (RT-PCR). Serologische Standardansätze leiden oft unzureichende Sensitivität und Ergebnisse können durch Kreuzreaktivität bei Patienten, die zuvor von anderen Flaviviren infiziert wurden, erschwert werden.
Daher bleibt die Nukleinsäure-Tests der zuverlässigste Weg zu erkennen und diese Viren zu unterscheiden. Erkennung von Zika und andere Moskitos übertragene Viren erfolgt in der Regel mittels RT-PCR oder Real-Time RT-PCR in unterschiedlichsten biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Serum, Urin, Speichel, Sperma, Muttermilch und zerebralen Fluid10,11. Urin und Speichel Proben werden über Blut, in der Regel bevorzugt, da sie zeigen weniger PCR-Hemmung, höheren Viruslast, Virus-Präsenz für längere Zeit und erhöhte Benutzerfreundlichkeit der Sammlung und Bearbeitung von12,13. RT-PCR-basierten diagnostischen Tests, umfassen jedoch umfangreiche Stichprobe Vorbereitungsschritte und teure thermische Rad-Ausrüstung, so dass es weniger optimal für den Point-of-Care.
Reversen Transkription Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung (RT-Lampe) als eine leistungsfähige RT-PCR-Alternative aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität14 entstanden, seine Toleranz für hemmende Stoffe in biologischen Proben15, und Betrieb auf single-Temperatur deutlich senkt die Komplexität und die damit verbundenen Kosten, eignet sich für Umgebungen mit geringen Ressourcen assay. RT-Lampe, da sie klassisch umgesetzt wird, besteht aus sechs Primer, die an acht verschiedenen Regionen innerhalb der Ziel-RNA binden. Es läuft bei konstanten Temperaturen zwischen 60 ° C und 70 ° C, und verwendet eine Reverse Transkriptase und einer DNA-Polymerase mit starken Strang Aktivität verdrängen.
In der Anfangsphase des RT-Lampe bilden vorwärts und rückwärts interne Primer (FIP und BIP, Abb. 1A) zusammen mit äußeren vorwärts und rückwärts Primer (F3 und B3) eine Hantel Struktur, die Samen der exponentiellen Amplifikation der Lampe. Verstärkung wird weiter beschleunigt durch die Schleife vorwärts und rückwärts Primer (LF und LB), die entworfen sind, um die einzelnen gestrandeten Regionen der Hantel zu binden, und führt zur Bildung von Concatemers mit mehreren sich wiederholenden Schleifen16. Klassische Lampe Tests basierend auf Trübung oder Auslesen von DNA verschuppen Farbstoffe ist nicht ganz geeignet für Point-of-Care-Erkennung von Zika, wo gewisse multiplexing ist17,18,19gewünscht. Multiplex ist nicht leicht in diesen Systemen erhalten sind anfällig für Fehlalarme durch Ziel-Vergrößerungen erzeugen.
Um diese Probleme zu verwalten, hinzugefügt die Literatur der klassischen RT-Lampe Architektur20,21,22eine zusätzliche Komponente in Form einer “Strang verdrängen Sonde”. Jede Sonde verfügt über eine Sequenz-spezifische Doppel-Strang-Region und eine einsträngige Priming-Region. Die Sonde mit der einzelsträngigen Region ist mit einer 5′-Fluorophor markiert, und die ergänzenden Sonde ist mit einem 3′-Ende Quencher modifiziert. In Ermangelung eines Ziels wird keine Fluoreszenz durch Hybridisierung der ergänzenden Sonde Stränge beobachtet bringt das Fluorophor und Durstlöscher in unmittelbarer Nähe. In Anwesenheit eines Ziels der einsträngige Teil der fluoreszierenden Sonde bindet mit seinem Komplement auf das Ziel und wird dann durch einen Strang verdrängen Polymerase verlängert. Polymerase-Erweiterung durch reverse Primer bewirkt, dass die Trennung des Teilprogramms Durstlöscher aus seine komplementäre Eindringmittel beschrifteten Strang, so dass Emission von FluoreszenzAbbildung 1 b() (). Mit diesem Design wird das Signal nach der Hantel-Bildung, wodurch die Chancen von falsch-positiven Signale generiert.
Die doppelsträngige Teil des Prüfpunkts Strang verdrängen kann beliebiger Reihenfolge, und wenn Multiplexen angewendet wird, die gleiche Reihenfolge verwendet werden, mit verschiedenen Fluorophor-Quencher Paaren. Mit dieser Architektur, Virus kontaminiert Urin, Serum oder Moskito wurden Proben zerquetscht auf Papier direkt an der Assay ohne Probenvorbereitung eingeführt. Dreifarben Fluoreszenz Auslesen für menschliche Auge sichtbar waren innerhalb von 30-45 min generiert und Signale wurden durch ein 3D-gedruckten Beobachtung-Feld, das eine blaue LED und einen Orangefilter verwendet visualisiert. Gefriertrocknung die RT-Lampe Reagenzien ermöglicht Bereitstellung dieses Kits Ressourceneinstellungen ohne Kühlung zu senken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Moskitos übertragene Viren einschließlich Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber bedrohen die Gesundheit und den letzten Höhepunkt der Zika-Ausbrüche den Bedarf an kostengünstigen Point-of-Care-Erkennung Alternativen für Patienten Diagnostik sowie für Moskito-Überwachung. Isothermen Amplifikationsverfahren wurden als erschwingliche Alternativen zu PCR-basierten Systemen entwickelt. Insbesondere wurden RT-Lampe-basierten Plattformen angewendet, um eine Vielzahl von Krankheitserregern zu erkennen. Die Verwendung von i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde zum Teil durch FDOH-7ZK15 und NIAID 1R21AI128188-01 unterstützt. Forschung, die in dieser Publikation berichtet wurde zum Teil durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases, und andererseits durch biomedizinische Forschung Programm des Florida Department of Health unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIH oder Florida Department of Health. Dynamische Kombinatorische Chemie GmbH ist bekannt für ihre Unterstützung und ihren Beitrag zu diesem Projekt anerkannt.
1 Denguevirus (Stamm BOL-KW010) wurde uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Florida Abteilung des Health Bureau des Labors. Zika-Virus und die asiatischen Linie des Chikungunya-Virus wurden gnädig von den Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention zur Verfügung gestellt. Die indischen Ozean-Linie des Chikungunya-Virus wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Robert Tesh (Welt Referenzzentrum für auftauchende Viren und Arboviren, durch die University of Texas Medical Branch in Galveston, Texas), die UF-FMEL. Wir danken S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer und K. Zirbel für die Unterstützung bei der Infektion-Studien. Wir danken auch M. S. Kim für die Bereitstellung von Q-Papier.
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
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