Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen
Summary
Het doel van dit protocol is voor het meten van het effect van glucose-gemedieerde wijzigingen in mitochondriale ademhaling in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen op intact 832/13 beta cellen met behulp van hoge-resolutie respirometrie.
Abstract
Hoge resolutie respirometrie zorgt voor het meten van zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondriën, cellen en weefsels. Beta-cellen spelen een cruciale rol in het lichaam door de controlerende bloedglucosespiegels door insuline secretie in reactie op verhoogde glucose concentraties. Insuline secretie wordt gecontroleerd door het glucose metabolisme en mitochondriale ademhaling. Daarom is het essentieel om de verbetering van de bèta-cel functie als een behandeling voor diabetes te kunnen meten intact bèta cel ademhaling. Met behulp van intact 832/13 INS-1 afgeleid beta cellen kunnen we het meten van het effect van de toenemende concentratie van glucose op cellulaire ademhaling. Dit protocol laat ons toe om bèta cel ademhaling meten in de aanwezigheid of afwezigheid van verschillende stoffen, zodat naar het vaststellen van het effect van de gegeven verbindingen op intact cel ademhaling. We laten hier zien het effect van twee natuurlijk voorkomende verbindingen, monomere epicatechine en curcumine, op bèta cel ademhaling onder de aanwezigheid van laag (2,5 mM) of hoge glucose (16.7 mM) voorwaarden. Deze techniek kan worden gebruikt om te bepalen van het effect van de verschillende verbindingen op intact bèta cel ademhaling in de aanwezigheid van verschillende concentraties van de glucose.
Introduction
Het primaire doel van de alvleesklier beta cel is om systeem normoglycemia door glucose-gestimuleerd insuline secretie. De beta-cellen zin fysiologische veranderingen in het circulerende glucose grotendeels te wijten aan de lage affiniteit, hoge capaciteit glucose transporter GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16.7 mM)1. Als bloedsomloop glucoseniveaus stijgen, vergemakkelijkt deze hoge capaciteit laag-affiniteit vervoerder een evenredige toename van de intracellulaire glucose binnen de beta-cel. Glucose wordt gemetaboliseerd door glycolyse, de TCA cyclus (tricarboxylic acid cyclus) en de mitochondriale ademhaling, wat resulteert in verhoogde cellulaire concentraties van de ATP (adenosinetrifosfaat). De verhoogde concentratie van ATP blokkeert de ATP gevoelige K+ kanalen, leidt tot membraan depolarisatie. Membraan depolarisatie zorgt ervoor dat de opening van de spanning gated Ca2 + kanalen en latere release van vesikel gebonden insuline korrels2. Beta cel dysfunctie is een kenmerk van Type 2 Diabetes (T2D), en resulteert in verminderde en slecht gecontroleerde insuline secretie en uiteindelijk bèta cel dood3. Mechanismen die handhaven of te verbeteren van beta cel functie kunnen worden gebruikt als een behandeling voor T2D.
Studies hebben aangetoond dat de gunstige effecten van natuurlijk voorkomende stoffen op basis van planten op de alvleesklier bèta cel4. Deze verbindingen hebben hun effect door toenemende beta celproliferatie, overleving, of de glucose-gestimuleerd insuline secretie. Als voorbeeld, hebben recente studies aangetoond dat monomeer Epicatechine glucose-gestimuleerd insuline secretie verbetert door verhoging van de mitochondriale ademhaling en verhoging van cellulaire ATP5niveaus. Daarom begrijpen hoe deze samenstellingen kunnen het verhogen van functionele bèta cel massa is belangrijk om de invloed van deze stoffen als potentiële therapeutics.
Cellular respiration kan worden gemeten door middel van een aantal tools. Gebruik van een hoge-resolutie respirometer zorgt voor de titratie van chemische modulatoren naar een permeabel of intact cel bevolking6. Dit hulpprogramma staat de toevoeging van verschillende stoffen, bij verschillende concentraties, waardoor een breed scala van informatie.
Gezien de intieme verbinding tussen glucose metabolisme en bèta-cel functie, staan metingen van cellulaire ademhaling kritisch tegenover. Metingen van cellulaire ademhaling kunnen worden gedaan met dat permeabel ofwel intact beta-cellen, elk met een eigen set van voordelen en nadelen van de7,8. Terwijl permeabilization van beta cellen kan men meet verschillende aspecten van de keten elektronentransport, doet zij dit zonder betrekking tot het mechanisme voor de ademhaling in het beta-cel, de glucose-opname en het metabolisme induceren. Dus, gebruik van unpermeabilized bèta cel ademhaling is een zeer handige techniek om te bepalen van de reactie van de beta-cellen op verschillende niveaus van de bloedglucose, met behulp van zuurstofverbruik als de uitlezing.
Het doel van deze techniek is voor het meten van zuurstofverbruik in intact INS-1 afgeleide 832/13 beta cellen. Deze techniek laat toe te bepalen van de reactie van de beta-cellen op voorwaarden van de unstimulatory glucose (2.5 mM glucose) en stimulerend glucose voorwaarden (16.7 mM glucose). Terwijl de unpermeabilized cellen niet toestaan ons te testen afzonderlijk complex I, II of III van het elektron vervoeren keten, de techniek staat u toe om metingen te maken met complexe IV remming (Oligomycin A), rekken ademhaling (FCCP-Carbonyl cyanide- 4– phenylhydrazone (trifluormethoxy)), en volledig geremd ademhaling (Antimycin A). Deze studie toont aan dat de werkzaamheid van het meten van de ademhaling in intact unpermeabilized alvleesklier beta cellen, alsmede het effect van twee natuurlijk voorkomende verbindingen, monomere epicatechine en curcumine, op bèta cel ademhaling.
Protocol
Representative Results
Discussion
De doelstelling van dit protocol is te gebruiken met een hoge resolutie respirometrie voor het meten van respiratoire tarieven in intact alvleesklier beta-cellen. Met deze methode kan de meting van de bèta cel-reactie op meer glucoseniveaus. Het protocol voorziet ook de voorbehandeling met verschillende verbindingen, zoals blijkt uit dit protocol met de natuurlijk voorkomende monomeer Epicatechine of curcumine4,5. Behandeling met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank leden van de Tessem en Hancock labs voor assistent en wetenschappelijke discussie. De auteurs bedanken Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) voor het verstrekken van de cacao afgeleide Epicatechine monomeer breuk. Deze studie werd gesteund door een subsidie van de Diabetes Action Research en Education Foundation naar JST.
Materials
| O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument for high-resolution respirometry |
| DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Computer program for analysing high-reolution respirometry |
| INS-1 832/13 cell line | Duke University Medical Center | NONE | Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard |
| Curcumin | Sigma | C7727 | Pre-treatment of beta cells |
| Cocoa epicatechin monomer | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson |
| Trypsin | Sigma | T4049 | For cell culture |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta cell media |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 beta cell media component |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4458 | 832/13 beta cell media component |
| HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer |
| Glutamine | Caisson | GLL01 | 832/13 beta cell media component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | 832/13 beta cell media component |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media component |
| NaCl | Fisher | S271 | Component of 10x SAB buffer |
| KCl | Sigma | P9541 | Component of 10x SAB buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Component of 10x SAB buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Component of 10x SAB buffer |
| D-(+)-Glucose Solution | Sigma | G8769 | Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of 1x SAB buffer |
| 35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Component of 1x SAB buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Component of 1x SAB buffer |
| 200 proof ethanol | Sigma | 459844 | Washing Oxygraph O2k Chambers |
| Oligomycin A | Sigma | O4876 | Chemicals for respiration assay |
| FCCP | Sigma | C2920 | Chemicals for respiration assay |
| Anitmycin A | Sigma | A8674 | Chemicals for respiration assay |
| BCA Protein Kit | Thermo Fisher | 23225 | For determining protein concentration |
References
- Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
- Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
- Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
- Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
- Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
- Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
- Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
- Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
- Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
- Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
- Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
- Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
- Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
- Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
- Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
- Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
- Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).
