Een Facile Protocol voor het genereren van Site-Specifically geacetyleerd eiwitten in Escherichia Coli
Summary
Uitbreiding van de genetische code dient als een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van een breed scala aan biologische processen, met inbegrip van eiwit acetylation. Hier tonen we een facile protocol misbruiken van deze techniek voor het genereren van homogeen geacetyleerd eiwitten op specifieke sites in Escherichia coli cellen.
Abstract
Posttranslationele modificaties die zich bij specifieke posities van eiwitten voordoen hebben aangetoond dat het spelen een belangrijke rol in een verscheidenheid van cellulaire processen. Onder hen is omkeerbare lysine acetylation één van de meest verspreide in alle domeinen van het leven. Hoewel talrijke massa spectrometrie gebaseerde acetylome studies zijn uitgevoerd, verdere karakterisering van deze vermeende acetylation doelstellingen beperkt gebleven. Een mogelijke reden is dat het moeilijk is te genereren louter geacetyleerd eiwitten op de gewenste positie door de meeste klassieke biochemische benaderingen. Om te overwinnen deze uitdaging, is de genetische code uitbreiding techniek toegepast voor het gebruik van het paar een gemanipuleerde pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, en haar cognaat tRNA van Methanosarcinaceae soorten, direct de cotranslational opneming van acetyllysine bij de specifieke site op de proteïne van belang. Na de eerste toepassing in de studie van Histon acetylation, heeft deze aanpak acetylation studies over een verscheidenheid van eiwitten vergemakkelijkt. In dit werk toonden we een facile protocol voor de productie van site-specifically geacetyleerd eiwitten met behulp van het model bacterie Escherichia coli als host. Malate dehydrogenase werd gebruikt als een voorbeeld van de demonstratie in dit werk.
Introduction
Posttranslationele modificaties (PTMs) van eiwitten optreden na het vertaalproces en ontstaan door covalente toevoeging van functionele groepen te aminozuurresidu’s, spelen een belangrijke rol in bijna alle biologische processen, met inbegrip van gene transcriptie, stressrespons, celdifferentiatie en metabolisme1,2,3. Tot op heden heeft ongeveer 400 onderscheidend geweest PTMs geïdentificeerde4. De complexiteit van het genoom en de Proteoom wordt versterkt tot een groot deel door eiwit PTMs, zoals ze reguleren de activiteit van het eiwit en de localisatie en invloed hebben op de interactie met andere moleculen zoals eiwitten, nucleïnezuren, lipiden en cofactoren5.
Eiwit acetylation is in de voorhoede van PTMs studies in de laatste twee decennia6,7,8,9,10,11,12. Lysine acetylation werd het eerst ontdekt in histonen meer dan 50 jaar geleden13,14, heeft al goed onderzocht, en is bekend in meer dan 80 transcriptiefactoren, regelgevers en verschillende eiwitten15, 16,17. Studies over eiwit acetylation hebben niet alleen ons te voorzien van een dieper begrip van de regulerende mechanismen, maar ook begeleide behandelingen voor een aantal ziekten veroorzaakt door disfunctionele acetylation18,19, 20 , 21 , 22 , 23. men geloofde dat lysine acetylation alleen in eukaryoten gebeurt, maar recente studies hebben aangetoond dat eiwitten acetylation speelt ook spelen een belangrijke rol in de bacteriële fysiologie, inclusief chemotaxis, zure weerstand, activering en stabilisatie van pathogeniteit eilanden en andere virulentie gerelateerde eiwitten24,25,26,27,28,29.
Een veelgebruikte methode om biochemically karakteriseren lysine acetylation maakt gebruik van plaats-geleide mutagenese. Glutamine wordt gebruikt als een nabootsen van acetyllysine vanwege zijn vergelijkbare omvang en polariteit. Arginine is gebruikt als een niet-geacetyleerd lysine mimic, aangezien het behoudt haar positieve lading onder fysiologische omstandigheden, maar kan niet worden geacetyleerd. Echter, beide nabootsers zijn geen echte isosteres en doen niet altijd de verwachte resultaten30opbrengst. De meest rigoureuze aanpak is het genereren van homogeen geacetyleerd eiwitten op specifieke lysine residuen, die is moeilijk of onmogelijk voor de meeste klassieke methoden als gevolg van de lage stoichiometrie van lysine acetylation in natuur7,11. Deze uitdaging heeft geweest ontrafeld door de uitbreidingsstrategie van de genetische code, waarin een gemanipuleerde pyrrolysyl-tRNA synthetase werkzaam variant van Methanosarcinaceae soorten in rekening te brengen van tRNAPyl met acetyllysine, maakt gebruik van de host translationeel machines om te onderdrukken de TECOS stop codon in het mRNA en regisseert de opneming van acetyllysine in de ontworpen positie van het doel eiwit31. Onlangs, hebben we dit systeem met een verbeterde EF-Tu-bindende tRNA32 en een bijgewerkte acetyllysyl-tRNA synthetase33geoptimaliseerd. Bovendien hebben we dit systeem van de verbeterde integratie in acetylation studies van malate dehydrogenase34 en tyrosyl-tRNA synthetase35toegepast. Hierin tonen wij het protocol voor het genereren van zuiver geacetyleerd eiwitten van het moleculaire klonen biochemische identificatie met behulp van malate dehydrogenase (MDH), die we hebben uitgebreid bestudeerd als een demonstratieve voorbeeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
De genetische opneming van noncanonical aminozuren (ncAAs) is gebaseerd op de onderdrukking van een toegewezen codon, meestal de amber stop codon TECOS36,37,38,39, van het tRNA ncAA-in rekening gebracht die bevatten de overeenkomstige anticodon. Zoals bekend de TECOS codon is erkend door de release factor-1 (RF1) bij bacteriën, en het kan ook worden onderdrukt door in de buurt van cognaat tRNA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de NIH (AI119813), het opstarten van de Universiteit van Arkansas en de award van Arkansas Biosciences Instituut.
Materials
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
| Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
| 4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
| Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
| IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
| Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
| PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
| BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
| nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
| BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
| ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
| Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
| Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |
References
- Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
- Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
- Walsh, C. T. . Posttranslational modification of proteins : expanding nature’s inventory. , (2006).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
- Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
- Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science’s STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
- Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
- Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation?. The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
- Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
- Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
- Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
- Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
- Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
- Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
- Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
- You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
- Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
- Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
- Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
- Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
- Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
- Jones, J. D., O’Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
- Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
- Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
- Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
- Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
- Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
- Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
- Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
- Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
- O’Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
- Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
- O’Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
- Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O’Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
- Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
- Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
- Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).
