הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום
Summary
בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקולים לחקור את התפקיד של שלפוחית חוץ-תאית (EVs) שפורסמו על ידי הפלזמודיום falciparum זיהום אריתרוציטים. בפרט, אנו מתמקדים האינטראקציות של EVs עם תאי אנדותל.
Abstract
מלריה היא מחלה מסכנת חיים הנגרמת על ידי טפילים הפלזמודיום , עם falciparum פ להיות הכי נפוצים ביבשת אפריקה, רוב מקרי מוות הקשורים מלריה ברחבי העולם. מספר גורמים, לרבות טפיל פחמיות רקמות בתפקוד כלי הדם, תגובות דלקתיות להשפיע על התפתחות המחלה אצל אנשים נגועים במלריה. פ falciparum-תאי דם אדומים (iRBCs) נגוע לשחרר שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EVs) המכילים סוגים שונים של מולקולות מטען המתווכות פתוגנזה ו סלולר תקשורת בין טפילים של המארח. EVs ביעילות שנלקחה על ידי תאים שבהם הם לווסת את תפקידם. כאן נדון אסטרטגיות כדי לטפל את התפקיד של EVs באינטראקציות טפיל-פונדקאי. ראשית, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור תיוג ומעקב EV הפנמה על-ידי תאי אנדותל, באמצעות צבע מקשר תא ירוק. שנית, מדווחים דרך פשוטה כדי למדוד את חדירות מעבר חד שכבתי תאי אנדותל באמצעות לתוספי שכותרתו fluorescently. לבסוף, אנו מראים כיצד לחקור את התפקיד של לא קידוד RNA מולקולות קטנות בתפקוד תאי אנדותל.
Introduction
על פי ארגון הבריאות העולמי, היו 212 מיליון מקרים חדשים של מלריה ברחבי העולם בשנת 2015, כ 429,000 אנשים מתו, בעיקר ילדים מתחת לגיל חמש שנים של גיל1. המנגנונים למחלות חמורות, אשר מזוהה לעתים קרובות עם חוסר תפקוד כלי הדם, נותר מעורפל2. הפלזמודיום– iRBCs מפרישים כדורים קטנים bi-השומנים קרום המכונה שלפוחית חוץ-תאית (EVs). זה ידוע כי אלה EVs שעשוי להיות רלוונטי לתהליך זיהום וכדי התגובה החיסונית מארח לזיהום; עם זאת, מעט מאוד ידוע על הפונקציה המדויק של אלה שלפוחית קטנה במהלך מלריה זיהום3. זה אפשרי כי הם משחקים שני תפקידים חשובים: מצד אחד, הם עשויים לתרום בפתוגנזה על ידי הפעלת מקרופאגים4,5; מצד שני, הם עשויים לתווך תקשורת סלולרית בין טפילים ובין טפילים מארח6,7. למעשה, טפילים יכולים להעביר חלבונים או חומצות גרעין בין אחד לשני דרך EVs. לדוגמה, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs יכול להעביר התקפה אלימה פקטור Serum Resistance-Associated (ההזמנות) ולאחר ניתן לייעד אריתרוציטים גם אחרים brucei טי וגם מארח8. יתר על כן, falciparum פ– iRBCs תקשורת בין אחד לשני על ידי העברת חומצות גרעין בתוך EVs. דבר זה מאפשר הטפילים למטב ולסנכרן את הצמיחה שלה. למעשה, EVs עשוי להיות הרגולטורים העיקריים של המרה gametocyte, לכן לתרום ברגולציה של שידור שלב7.
לא רק לעשות EVs לווסת הטפילים, הם גם לתווך טפיל-פונדקאי אינטראקציות. לאחרונה גילינו כי EVs מ iRBCs מכילים מארח-derived מיקרו Rna (miRNAs; מינים RNA קטנים בטווח של 21-25 נוקלאוטידים9) שנלקחו על ידי תאי אנדותל אדם. MiRNAs ב- EVs טופס אורווה מורכבים עם Ago2 (חבר של RNA-induced שתיקת מורכבים), אשר ברגע מועברת לתאי הנמען, הוא מסוגל במיוחד ביטוי גנים ואף להשפיע על מכשול מאפייני תאים10. פרוטוקולים סטנדרטיים פותחו כדי לחקור את הפונקציה של EVs. כאן, נתאר תחילה פרוטוקול המאפשר תיוג פלורסנט של EVs לחקור ספיגת שלהם על ידי תאים הנמען. בנוסף, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, אפשרי לעקוב אחר גורלם של EV בתוך התא. מספר צבעי פלורסנט יכול לשמש כדי לעקוב אחר EVs. לצבוע אמין-ריאקטיבי, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl אסתר (CFSE), Calcein-אם הופכים פלורסנט פעם אחת בתוך השלפוחיות המוגלתיות. אנחנו מעדיפים להשתמש בתווית amphiphilic, PKH, כי זה נותן אות אחיד יותר ויותר בהיר. גישה זו מספקת מידע חשוב להבין את האינטראקציות בין EVs ותאים הנמען. אמנם במקרים מסוימים EVs לאגד פני השטח של התאים, יש שלפוחית נלקחים במהירות. על תפיסה, EVs להעביר מטענים שלהם התאים, שבהם הם מפעילים את הפונקציות התקינה שלהם.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי למדוד את הפונקציה מכשול של ה תאי אנדותל במבחנה על ידי לכימות בהעברת לתוספי פלורסנט דרך טפט הסלולר. ניתן להשתמש המשדרים יותר רגישים כגון סמני radiolabeled. עם זאת, הם דורשים זהירות מיוחדת לשימוש. מבחני אחרים קיימים כדי למדוד את הפונקציה מכשול במבחנה כגון transendothelial ההתנגדות החשמלית (TEER), אשר מודד צמוד לצומת שלמות. סוף סוף להמחיש זואי-1, חלבון צמוד לצומת, על-ידי immunofluorescence מאפשרת הערכה של שלמות צומת חזק כמו גם10. מאז EVs הם ישויות הטרוגנית ומורכבת המכיל מספר מטענים עם פוטנציאל מאפיין רגולטוריות, זה שימושי כדי overexpress של RNA ספציפיים כדי לחקור את השפעתו על התא הנמען. לכן, אנחנו גם להגדיר פרוטוקול אשר מטרתה ליצור שורות תאים יציב לבטא את miRNA של ריבית10.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמה טפילים, לרבות Toxoplasma, Trypanosoma, לישמניה Trichomonas לעורר על שחרורו של EVs התא המארח נגועים. בהתאם פתוגנים, EVs שפורסמו ניתן לווסת את התגובה החיסונית מארח או לתווך תקשורת סלולרית בין טפילים6. ובכל זאת, יש מעט עדויות רומז כיצד אלה שלפוחית קטנה לתרום מחלת המלריה. . הנה, שתיארנו במספר דרכים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מבחינה כלכלית נתמך בחלקה על ידי קרן נוברטיס רפואי – ואת המחקר הביולוגי (כדי פים), של גוטפריד, יוליה Bangerter-Rhyner-Stiftung (ל MW, פים) של הבריכה מחקר של האוניברסיטה של פריבורג (כדי פים). מענקים נוספים כוללים המלגות מצוינות הממשלה השוויצרית עבור חוקרים זרים (כדי KAB ו- SM). אנו מודים איזבל Fellay, הס Kharoubi סולנג לקבלת תמיכה טכנית.
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
- WHO. . WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
